[發(fā)明專利]一種檢測篩查新冠病毒Y453F突變的方法及試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202211081697.0
• 申請日: 2022-09-06
• 公開（公告）號: CN115287375A
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜憶南;宗凱;曹華科;祝亞亭;李倩
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

1.一種檢測篩查新冠病毒Y453F突變的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括：

一組RT-RAA擴(kuò)增引物：

RT-RAA上游引物：

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；

RT-RAA下游引物：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；

兩種CRISPR特異性檢測的crRNA：

Cas13-Y453F crRNA：

5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；

Cas12-Y453F crRNA：

5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；

RNA熒光探針：

5’-FAM-mArArΜrGrGrCmAmArArΜrGrGrCmA-BHQ1-3’；

其中，m代表2位氧甲基修飾，r代表核糖核苷酸；

DNA熒光探針：

5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測篩查新冠病毒Y453F突變的試劑盒，其特征在于：還包括HEPES緩沖液、MgCl₂溶液、10×NEB bμffer2.1緩沖液、RNase inhibitor、T7 RNApolymerase、無RNA酶水。

3.一種非診斷目的的檢測篩查新冠病毒Y453F突變的方法，其特征在于：包括下列步驟：

步驟1：將待檢測樣本浸入病毒保存液中，然后用RNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，得到待檢核酸；

步驟2：向一容納有蛋白酶凍干粉的反應(yīng)管中，加入41.5μL的Bμffer A溶液，2μL的RT-RAA上游引物，2μL的RT-RAA下游引物以及2μL待檢核酸，然后加2.5μL的Bμffer B溶液，蓋上反應(yīng)管的管蓋后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到核酸擴(kuò)增產(chǎn)物；

RT-RAA上游引物：

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGtatagcttggaattctaacaatcttgattc-3’；

RT-RAA下游引物：5’-accggcctgatagatttcagttgaaatatc-3’；

步驟3：配置第一CRISPR反應(yīng)混合液：將0.4μL的濃度為1M的HEPES緩沖液、0.18μL的濃度為1M的MgCl₂溶液、0.8μL的濃度為10μM的rNTP mix、2μL的濃度為的63.2ng/μL的LwaCas13a、1μL的濃度為40Μ/μL的RNase inhibitor、0.1μL的濃度為50Μ/μL的T7 RNApolymerase、0.5μL的濃度為10ng/μL的K1 crRNA或P1 crRNA、0.2μL的濃度為100μM的RNA熒光探針和12.82μL的無RNA酶水混合；配置第二CRISPR反應(yīng)混合液：將1μL的濃度為1μM的LbaCas12a、1μL的濃度為15ng/μL的B2 crRNA、2μL的10×NEB bμffer2.1、0.1μL的濃度為100μM的DNA熒光探針和12.9μL的無RNA酶水混合；

Cas13-Y453F crRNA:

5’-ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc-3’；

Cas12-Y453F crRNA：

5’-guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau-3’；

RNA熒光探針：

5’-FAM-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-BHQ1-3’；其中，m為2位氧甲基修飾，r為RNA

DNA熒光探針：

5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’；

步驟4：取2μL步驟2得到的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物加入到步驟3配置得到的第一CRISPR反應(yīng)混合液或第二CRISPR反應(yīng)混合液，37℃孵育30分鐘；通過下列方法進(jìn)行判斷：

1、通過熒光定量PCR儀孵育并同時(shí)檢測熒光，或直接水浴最后肉眼觀察熒光變化；

2、在CRISPR反應(yīng)孵育開始時(shí)使用qPCR儀器讀取FAM通道下的熒光值，37℃孵育20個循環(huán)，每個循環(huán)間隔1.5分鐘，每次循環(huán)結(jié)束記錄一次熒光信號，通過最終熒光信號強(qiáng)度判斷Y453F檢測結(jié)果，即熒光值大于3000代表Y453F檢測陽性，熒光值小于2000代表Y453F檢測陰性，若熒光值處于2000-3000之間則重新檢測一次，若熒光值依然為2000-3000則判定Y453F檢測陽性；若現(xiàn)場無qPCR等熒光讀取儀器，亦可等反應(yīng)完成后將反應(yīng)管置于激發(fā)波長為485nm的透射光源下觀察顏色變化確定檢測結(jié)果；Y453F檢測陽性的反應(yīng)管會發(fā)出黃綠色熒光，Y453F檢測陰性反應(yīng)管則無熒光。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非診斷目的的檢測篩查新冠病毒Y453F突變的方法，其特征在于：bμffer A溶液配置方法為：向1L水中加入50mmol的Tris緩沖液，100nmol的醋酸鉀，20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫蘇糖醇；BμfferB溶液為濃度為280mM的醋酸鎂溶液。