[發明專利]一種端粒酶活性基因檢測試劑盒、引物組及探針引物與檢測方法

在審

• 申請號: 202211075535.6
• 申請日: 2022-09-05
• 公開（公告）號: CN116042792A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 王金固
• 申請（專利權）人: 杭州拜賽思生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 天津智行知識產權代理有限公司 12245
• 代理人: 韋金騰

本發明涉及一種端粒酶活性基因檢測試劑盒、引物組及探針引物與檢測方法，包括樣品處理液、漂洗液、洗脫液、磁珠懸浮液、PCR?buffer、引物組、酶反應混合液，解決了RNA易降解難題，操作簡便，兼顧了各組分之間的兼容性，試劑盒可使受檢樣本通過樣品處理獲得穩定、完整的靶向RNA復合物，富集后的RNA復合物可直接用于后續端粒酶逆轉錄酶亞基hTERT?mRNA基因的檢測，試劑盒中在直擴酶反應體系中可將實驗周期控制在30分鐘以內，實現全自動化檢測，本試劑盒的檢測方法可靈敏的檢出生物樣本中hTERT?mRNA的基因存在，該方法可在臨床上用來對90％以上存在端粒酶活性的癌細胞進行定性及定量檢測。

技術領域

本發明涉及分子生物學、醫學檢驗技術領域，特別涉及一種端粒酶活性基因檢測試劑盒、引物組及探針引物與檢測方法。

背景技術

端粒是染色體末端由重復序列DNA和蛋白質組成的特殊結構,其DNA序列高度保守，在細胞增殖及衰老等過程中發揮重要作用。端粒可減少染色體末端縮短，亦可避免相鄰染色體末端融合，隨著細胞復制次數的增多,端粒長度逐漸變短,當達到某一臨界點時,使細胞退出周期并開始衰老，當端粒長度縮短到傷害DNA的臨界值而細胞又無法補償此長度縮短時，染色體穩定性變差，最終導致細胞死亡、機體衰老。

端粒酶是一種核糖核蛋白復合體,是一種特殊的逆轉錄酶,當其激活時,能以其自身的RNA為模板合成端粒DNA,可阻止端粒的丟失,維持端粒的長度,使細胞發展成為永生態細胞或癌細胞。在超過90％的永生化細胞和癌細胞中可檢測到端粒酶活性,但在大多數正常體細胞中檢測不到,這表明在永生化和癌變形成過程中端粒酶的激活是重要事件。

端粒酶由3個亞單位構成,即端粒酶RNA(hTR),端粒酶結合蛋白(TP1)和催化亞單位(hTERT)。端粒酶催化亞單位(hTERT)是端粒酶活性的決定關鍵部分,它的過度表達在細胞永生化和人類惡性腫瘤的發生、發展中起關鍵作用，因此端粒酶可以作為組織癌變及癌前病變的有效標志物。

目前，檢測端粒酶活性最常用的方法分為直接檢測端粒酶(蛋白及RNA的結合復合物)的活性和間接檢測端粒酶(催化亞基的mRNA量)的活性。直接檢測端粒酶(蛋白及RNA的結合復合物)的活性時主要檢測它是否可以延伸DNA模板，然后跑膠或者探針雜交，檢測DNA延伸的長度，以此來判斷端粒酶的活性高低，該方法需要提取蛋白，操作較復雜，靈敏度不高；放射性同位素標記；重復性差、周期長。間接檢測端粒酶(催化亞基的mRNA量)的活性靈敏度高，操作相對簡便；但是在多數細胞中，端粒酶催化亞基的表達很難檢測到。

傳統的RNA檢測試劑存在試劑兼容性問題，試劑殘留的各種影響PCR擴增的抑制劑導致痕量的RNA樣本很難被檢出。同時繁雜的實驗步驟會造成樣本中RNA被RNA酶所降解，導致檢測失敗。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明的目的在于提供一種端粒酶活性基因檢測試劑盒、引物組及探針引物與檢測方法，以解決上述技術問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種端粒酶活性基因檢測試劑盒用引物組，包括上游引物，所述上游引物序列號包括：

Forward?primer1：CTGGACGATATCCACAGGGC

Forward?primer2：TGTCAAGGTGGATGTGACGG

Forward?primer3：GTGGCACGGCTTTTGTTCAG

Forward?primer4：GTGGCACGGCTTTTGTTCAG

Forward?primer5：CAAGCTGTTTGCGGGGATTC

Forward?primer6：CATCAGGGGCAAGTCCTACG

Forward?primer7：AAACCTTCCTCAGCTATGCCC