[發(fā)明專利]一種基于脂肪外泌體的神經(jīng)元轉(zhuǎn)染方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211075459.9
• 申請日: 2022-09-05
• 公開（公告）號: CN115141804B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王進;畢艷
• 申請（專利權(quán)）人: 南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/10;C12N7/01
• 代理公司: 南京禾祁專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32462
• 代理人: 孫峰

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，具體地，涉及一種基于脂肪外泌體的神經(jīng)元體內(nèi)、體外轉(zhuǎn)染方法，進一步地，涉及該方法的具體應(yīng)用。本發(fā)明方法能夠在體內(nèi)和體外有效地實現(xiàn)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染，且細胞毒性低，免疫原性低，轉(zhuǎn)染效率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，具體地，涉及一種基于脂肪外泌體的神經(jīng)元體外轉(zhuǎn)染方法，進一步地，涉及該方法的應(yīng)用。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)染是將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)到細胞中的過程，是有效改變細胞中基因表達的重要手段。其可沉默內(nèi)源蛋白表達/驅(qū)動外源基因表達以及蛋白質(zhì)修飾的特性，讓轉(zhuǎn)染成為研究調(diào)控神經(jīng)元功能的關(guān)鍵分子的重要手段。然而，神經(jīng)元是一種高度分化的細胞，不同于其他細胞，基于成熟神經(jīng)元脆弱的特質(zhì)，神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染通常效率低且難以存活，使得對其轉(zhuǎn)染具有很強的挑戰(zhàn)性。

目前針對神經(jīng)元轉(zhuǎn)染的方法主要有：核轉(zhuǎn)染、基因槍和病毒轉(zhuǎn)染。但目前這三種方法都有較明顯的缺陷：核轉(zhuǎn)染細胞致死率高，對細胞的需求量大，且只能針對體外細胞進行操作；基因槍雖然對細胞損害低，但是其轉(zhuǎn)染效率不高且也只能對體外細胞進行操作；病毒轉(zhuǎn)染雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但是其準備程序復(fù)雜，構(gòu)建病毒周期長，環(huán)節(jié)多，易出錯且費用高。而應(yīng)用最為廣泛的脂質(zhì)體介導(dǎo)方法對神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率極低，且轉(zhuǎn)染試劑的細胞毒性高。目前尚無能夠同時在體內(nèi)和體外實現(xiàn)神經(jīng)元高效轉(zhuǎn)染的方法。

外泌體(Exosome)是由不同細胞類型在體內(nèi)分泌的質(zhì)膜囊泡(Ibrahim and Marbán (2016) Annu Rev Physiol. 78:67-83)；反映其來源細胞的內(nèi)含物、其正常狀態(tài)或病理生理狀態(tài)。外泌體主要來源于細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)外膜與細胞膜融合釋放到胞外基質(zhì)中；其被發(fā)現(xiàn)存在于眾多生物液體中，例如血液、尿液、唾液、腦脊髓液、淋巴液、膽汁、肺泡灌洗液、精液、滑膜液、羊水、母乳等。其可傳輸多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，例如功能蛋白，核酸（例如DNA、mRNA、microRNA、siRNA），脂質(zhì)，長非編碼RNA(lncRNA)等等，并進入受體細胞并發(fā)揮生物學功能，從而參與細胞間的信息傳遞(Valadi et al. (2007) NatCell Biol., 9(6):654-9; Li et al. (2016) Nat Commun. 7:10872; Liu et al.(2015) Cell Metab. 22(4):606-18)。同時，外泌體能夠穿過嚴格的生物屏障，如血腦屏障、胎盤屏障(Alvarez Erviti et al. (2011) Nat Biotechnol. 29(4):341-5; Holderet al. (2016) Traffic 17(2): 168-78; Shi et al. (2017) Biochem. Biophys. ResCommun. 483(1):602-8)；因此，其有希望成為物質(zhì)遞送的有效載體。

鑒于此，本發(fā)明期望提供一種基于脂肪外泌體的高效神經(jīng)元轉(zhuǎn)染方法，能夠在體外有效地實現(xiàn)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染，同時細胞毒性低，免疫原性低，轉(zhuǎn)染效率高。

發(fā)明內(nèi)容

為解決神經(jīng)元轉(zhuǎn)染中存在的上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明首先由此提供了一種基于脂肪外泌體的、高效轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的方法，在體外可實現(xiàn)對神經(jīng)元的高效轉(zhuǎn)染，且安全性高，操作簡單。

首先，在第一方面，本發(fā)明涉及一種神經(jīng)元的體外轉(zhuǎn)染方法，其中，所述方法基于脂肪外泌體實現(xiàn)，具體地，所述方法包括如下步驟：

1）脂肪細胞培養(yǎng)獲得標準化脂肪外泌體；

2）將遺傳物質(zhì)包裝至分離的脂肪外泌體中；

3）將包裝遺傳物質(zhì)的脂肪外泌體與原代神經(jīng)元共培養(yǎng)，實現(xiàn)神經(jīng)元轉(zhuǎn)染。

在一個實施方案中，所述標準化脂肪外泌體是將腺相關(guān)病毒通過脂肪原位注射，進行脂肪培養(yǎng)后獲得；在優(yōu)選的實施方案中，所述腺相關(guān)病毒為rAAV-siDicer。

在一個實施方案中，其中所述轉(zhuǎn)染在體外進行。