[發明專利]植物通用型原生質體制備和瞬時轉化方法、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202211073043.3
• 申請日: 2022-09-02
• 公開（公告）號: CN115386531A
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 陳新龍;尚麗娜;何光華;張秋麗;洪濤;王宗兵
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/20;A01H6/46;A01H5/04;A01H6/82
• 代理公司: 重慶信航知識產權代理有限公司 50218
• 代理人: 穆祥維

1.植物通用型原生質體制備和瞬時轉化方法，其特征在于，所述方法中采用了一種通用型植物細胞壁酶解液即WQ1酶解液、一種通用型植物原生質體保存液即WQ2保存液、一種通用型植物原生質體重懸液即WQ3重懸液及一種通用型植物原生質體轉化液即WQ4轉化液，所述WQ1酶解液由1.0％～3.0％(w/v)的纖維素酶R-10、0.25％～1.0％(w/v)的離析酶R-10、300～600mM的D-Mannitol、10～40mM的MES、0.1％～0.2％(w/v)的BSA、0％～0.05％(v/v)的β-巰基乙醇和無菌超純水組成，所述WQ1酶解液的配制過程中需調節pH值至5.6～5.8，在-80～-20℃長期保存；所述WQ2保存液由140～154mM的NaCl、115～125mM的CaCl₂·2H₂O、0.2～4mM的MES、3～5mM的KCl、1～5mM的蔗糖、1～5mM的葡萄糖和無菌超純水組成，所述WQ2保存液的配制過程中需調節pH值至5.6～5.8，過濾除菌后在-80～-20℃長期保存；所述WQ3重懸液由15～25mM的MgCl₂·6H₂O、300～600mM的D-Mannitol、2～4mM的MES和無菌超純水組成，所述WQ3重懸液的配制過程中需調節pH值至5.6～5.8，過濾除菌后在-80～-20℃長期保存；所述WQ4轉化液由100～300mM的CaCl₂·2H₂O、200～600mM的D-Mannitol、35％～40％(w/v)的PEG4000和無菌超純水組成，所述WQ4轉化液的配制過程中需調節pH值至5.6～10.0，所述WQ4轉化液可現配現用，也可在4℃下有效保存兩天；所述方法包括原生質體制備方法和原生質體瞬時轉化方法，所述原生質體制備方法包括酶解和純化兩個步驟，所述原生質體瞬時轉化方法包括酶解、純化、重懸、轉化、漂洗和培養六個步驟，且所述原生質體制備方法和原生質體瞬時轉化方法中的酶解和純化步驟相同，各步驟詳細如下：

(1)酶解：用刀片將多個新鮮幼嫩植物組織縱向劃切成0.5～1mm的細絲或橫向劃切成0.5～1mm的細段，置于含有5～20mL WQ1酶解液的50mL燒杯中，在真空度為100～150mbar的真空腔室中避光滲透10min，將燒杯固定至轉速為40～50rpm、溫度為24～28℃的搖床，避光培養酶解2～6h；收集原生質體前，提高搖床轉速至80～100rpm，搖動1～5min，使原生質體充分釋放；用經過WQ2保存液潤洗過1次的200目網篩過濾，將濾液轉移至50mL無菌離心管，分別用5mL的WQ2保存液清洗酶解器皿和未消化的植物組織2～3次，收集洗液并轉入裝濾液的離心管中待用；

(2)純化：將步驟(1)收集原生質體混液的離心管至于離心機中，在溫度為4℃、離心力為100～200g、升速為3、降速為3條件下離心2min；用針管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁緩慢勻速加入20mL WQ2保存液，輕搖重懸，在溫度為4℃、離心力為100～200g、升速為3、降速為3條件下離心2min；用針管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁緩慢勻速加入10mLWQ2保存液，輕搖重懸，在溫度為4℃、離心力為100～200g、升速為3、降速為3條件下離心2min；用針管或吸管吸除上清，保留沉淀，沿管壁緩慢勻速加入1mL WQ2保存液，輕搖重懸，在冰上靜置20～30min；用針管或吸管吸除上清，沉淀為純化的原生質體，在顯微鏡下檢察原生質體狀態；

(3)重懸：將步驟(2)純化后的原生質體，在溫度為4℃、離心力為100～200g、升速為3、降速為3條件下離心2min沉淀原生質體；用針管或吸管吸除上清，用相應體積的WQ3重懸液重懸原生質體，調整原生質體密度至最優；

(4)轉化：在2mL無菌圓底離心管底部加入10～20μL純化后濃度為1～3μg/μL的質粒和200μL已調整密度的原生質體，輕搖混勻；沿管壁加入210～220μL的WQ4轉化液，迅速輕搖混勻；在24～28℃環境下避光孵育5～30min，孵育期間可間歇輕搖混勻；沿管壁緩慢加入1.5mL的WQ2保存液，緩慢顛倒離心管混合樣品以終止轉化；

(5)漂洗：將終止轉化的原生質體混合液在溫度為24～28℃、離心力為100～200g、升速為3、降速為3條件下離心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁緩慢勻速加入2mL的WQ2保存液，緩慢顛倒離心管重懸原生質體，在溫度為24～28℃、離心力為100～200g、升速為3、降速為3條件下離心2min；去除上清，保留沉淀，沿管壁緩慢勻速加入500μL的WQ2保存液，輕搖混勻；

(6)培養：將步驟(5)漂洗后的原生質體轉入無菌細胞培養板，在24～28℃條件下避光靜置培養12～48h，在熒光顯微鏡下觀察分析。