[發明專利]植物葉片原生質體的快速制備和轉化方法、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202211073042.9
• 申請日: 2022-09-02
• 公開（公告）號: CN115386530A
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 陳新龍;尚麗娜;何光華;張瑩瑩
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20;A01H6/54;A01H6/82;A01H6/50;A01H6/02;A01H6/06
• 代理公司: 重慶信航知識產權代理有限公司 50218
• 代理人: 穆祥維

本發明提供一種植物葉片原生質體的快速制備和轉化方法，方法中采用了一種原生質體制備及轉化試劑，試劑包括WQ1酶解液、WQ2保存液、WQ3重懸液和WQ4轉化液，方法包括酶解、純化、重懸、轉化、漂洗和培養步驟。本發明還提供一種植物葉片原生質體快速制備試劑盒和轉化試劑盒，一種植物葉片原生質體快速制備方法及試劑盒在植物葉片原生質體制備中的應用，以及一種植物葉片原生質體快速轉化方法及試劑盒在植物葉片原生質體轉化中的應用。本方法獲得的原生質體完整性好、轉化效率高、實驗重復性強、長期保存不易破損，可在1.5小時內完成高質量原生質體的制備及轉化過程，突破了國內外現有植物原生質體制備和轉化的時間限制，應用范圍廣，應用價值高。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種植物葉片原生質體的快速制備和轉化方法、試劑盒及應用。

背景技術

原生質體是指去除細胞壁后由細胞質膜包被的具有生命活力的植物細胞。原生質體具有結構簡單、發育同步性好和易導入外源遺傳物質等特點，是植物基因瞬時轉化的良好材料。原生質體瞬時轉化是進行植物基因瞬時表達、啟動子活性分析、轉錄因子與順式作用元件相互作用、蛋白質間的相互作用以及蛋白質亞細胞定位等研究的重要方法。而本申請的發明人經過研究發現，國內外現有植物葉片原生質體制備和轉化方法均至少存在多個如下缺點：

需要大量植物材料：如CN111676183A公開的一種油菜葉肉原生質體的制備方法，需要取20片葉子進行實驗，不適用于稀有植物材料的原生質體制備與轉化。

需要使用大量試劑：如CN109355246B公開的一種擬南芥葉肉細胞原生質體及其制備方法和應用，需要用20mL酶解液等大量試劑，成本高。

通用性差：如CN109355246B公開的一種擬南芥葉肉細胞原生質體及其制備方法和應用、CN105316276B公開的快速獲得鹽生草葉片原生質體的方法、CN111676183A公開的一種油菜葉肉原生質體的制備方法，均僅可應用于一種植物葉片。

穩定性差：在用同一種方法開展不同批次的實驗時，不同批次原生質體的瞬時轉化效率差異較大，實驗結果穩定性差。

原生質體制備速度慢：現有方法中，取材方法繁瑣、細胞壁酶解時間長、原生質體純化步驟復雜等多種因素會降低原生質體制備速度。

原生質體保存時間短：原生質體的質量不佳或原生質體保存液性質不穩定導致無法長時間完整保存原生質體。

原生質體產量低：植物材料選擇、植物材料處理、細胞壁消化等方面存在不足會降低原生質體產量。

原生質體易破裂：在原生質體制備過程中易發生破裂，或在瞬時轉化后發生大量破裂現象，或在轉化后繼續培養過程中容易破裂。

操作過程復雜：現有方法中，需要對樣品進行真空滲透，需要多次更換離心管和培養器皿，需要用BSA溶液對各類原生質體容器進行預處理，不僅操作步驟多、轉化過程復雜，而且成本高。

轉化效率低下：高質量質粒的提取和保存、原生質體制備及轉化環境條件的控制、試劑的穩定性、原生質體的活力等方面存在不足會降低原生質體轉化效率。

依賴進口試劑：現有原生質體的制備及轉化方法，如Wang等(2022)[An Efficientand Universal Protoplast Isolation Protocol Suitable for Transient GeneExpression Analysis and Single-Cell RNA Sequencing.Int.J.Mol.Sci.2022；23(7):3419.]報道的方法，依賴進口試劑，而進口試劑的購買難、成本高、貨期長，在實際推廣應用過程中存在諸多不便。

試劑種類較多：在原生質體制備和轉化過程中，用到較多種類的試劑，不僅增加試劑配制的難度，也會影響到原生質體的活力。