[發明專利]一種分離純化流感病毒感染上皮細胞外泌體的方法

在審

• 申請號: 202211055896.4
• 申請日: 2022-08-30
• 公開（公告）號: CN115322954A
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 吳瑩;黃英娜;張祖榮;鐘婧
• 申請（專利權）人: 柳州市人民醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南寧新途專利代理事務所(普通合伙) 45119
• 代理人: 但玉梅

本發明屬于生物技術領域，提供一種分離純化流感病毒感染上皮細胞外泌體的方法，具體為：將樣品離心，棄除底部的細胞碎片，收集細胞上清備用；細胞上清做梯度離心處理；用0.22um膜過濾，濾液進行超高速離心管，收集管底的沉淀物；重懸沉淀物；采用免疫磁珠法純化外泌體，即去除流感病毒顆粒的外泌體。本發明的方法結合了梯度離心以及免疫磁珠法，該方法操作步驟簡單、易實施，所提取的外泌體含量較多，純度較高，且不混有病毒粒子，有利于外泌體后續的功能研究。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種分離純化流感病毒感染上皮細胞外泌體的方法。

背景技術

流感(Influenza)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。主要通過飛沫傳播，呈現季節性流行趨勢，感染范圍包括禽類，人類和豬等許多物種。據統計，全世界平均每年有300～500萬人感染，25～50萬人死于流感，流感病毒感染仍是人類面臨的主要公共衛生問題。研究表明，外泌體參與病毒感染細胞與免疫細胞間的“對話”，可在細胞間轉移蛋白質、mRNA和miRNA等物質，在病毒感染細胞與免疫細胞之間的溝通中發揮重要作用，近年來外泌體與病毒的研究成為熱點，外泌體的提取與純化對于外泌體研究十分重要。

然而，目前關于流感病毒感染呼吸道上皮細胞外泌體的研究較少，外泌體粒徑大小為40～150nm，而流感病毒粒徑為80～120nm，存在重疊的部分，常用的超速離心法無法將外泌體和流感病毒粒子分開，從而影響后續的研究。因此如何有效分離純化流感病毒感染細胞后的外泌體是外泌體功能研究中極為重要的問題。

發明內容

本發明的發明目的在于：針對上述存在的問題，提供一種分離純化流感病毒感染上皮細胞外泌體的方法，采用本發明的方法可以去除外泌體中的流感病毒粒子，獲得純度高的外泌體。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種分離純化流感病毒感染上皮細胞外泌體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)收集流感病毒感染的樣品，于4℃以2000×g離心30min，棄除底部的細胞碎片，收集細胞上清備用；

(2)將步驟(1)處理后的細胞上清做以下處理：

樣本于4℃以300×g離心10min，除去死細胞，取上清；

樣本于4℃以2,000×g離心10min，除去細胞碎片，取上清；

樣本于4℃以10,000×g離心30min，除去其他雜質，取上清；

用0.22um膜過濾，除去細胞上清中大于0.22um的囊泡，取濾液；

濾液樣本轉移至超高速離心管中，于4℃以110,000×g離心90min，棄上清，收集管底的沉淀物即為外泌體粗品；

(3)用4℃預冷的10mL 1×PBS重懸外泌體粗品；重懸液于4℃以110,000×g離心90min，棄掉上清；用1×PBS重懸沉淀，分裝，標記為流感病毒-exo樣本；-80℃保存；

(4)取400μl所得的流感病毒-exo樣本與50μl CD9磁珠、CD63磁珠、CD81磁珠混合物于室溫下共孵育，得到磁性包被的產物；

(5)將μMACS分選柱放置于與磁珠分選儀相連的μMACS分選架上，并在分選柱頂部加入100μL平衡緩沖液平衡柱子，后使用100μL分離緩沖液洗滌柱子，洗3次，注意下一次加入緩沖液前應該等上一次的液體排空；

(6)將磁性包被的產物加到的μMACS分選柱中，用200μL分離緩沖液洗滌，洗4次，未結合磁珠的分離緩沖液會順利流出分選柱，注意下一次加入緩沖液前應該等上一次的液體排空；

(7)將μMACS分選柱移出磁場，用150μL分離緩沖液洗脫即可得到純化的外泌體，即去除流感病毒顆粒的外泌體。