[發明專利]一種用于赭曲霉毒素A檢測的級聯FRET適配體傳感器及方法

在審

• 申請號: 202211046714.7
• 申請日: 2022-08-30
• 公開（公告）號: CN115453107A
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 王柳;俞靜;徐霞紅;何開雨;權浩然
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/533;G01N33/53;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

1.一種用于赭曲霉毒素A檢測的級聯FRET適配體傳感器，其特征在于，級聯FRET適配體傳感器由供體聚合物納米粒子和受體聚合物納米粒子交聯得到，供體聚合物納米粒子修飾有OTA適配體，受體聚合物納米粒子修飾有cDNA和熒光受體基團。

2.根據權利要求1所述的一種用于赭曲霉毒素A檢測的級聯FRET適配體傳感器，其特征在于，級聯FRET適配體傳感器的制備方法包括以下步驟：

步驟1)分別合成供體聚合物納米粒子和受體聚合物納米粒子，供體聚合物納米粒子和受體聚合物納米粒子負載不同熒光染料；

步驟2)在供體聚合物納米粒子上修飾OTA適配體，在受體聚合物納米粒子上修飾cDNA和受體熒光基團；

步驟3)將步驟2的供體聚合物納米粒子和受體聚合物納米粒子通過DNA雜交實現交聯，從而得到用于赭曲霉毒素A檢測的級聯FRET適配體傳感器。

3.根據權利要求2所述的一種用于赭曲霉毒素A檢測的級聯FRET適配體傳感器，其特征在于，所述步驟(1)中：

供體聚合物納米粒子和受體聚合物納米粒子的外殼均為疊氮/羧酸雙官能團修飾的PMMA-AspN₃；

供體聚合物納米粒子內部包裹的染料為發射波長在500-540nm的綠色陽離子染料與反離子的復合物；受體聚合物納米粒子內部包裹的染料為激發波長在500-540nm、發射波長在545-600nm的黃色陽離子染料與反離子的復合物；

所述綠色陽離子染料包括羅丹明110、羅丹明Green、羅丹明123中的一種；所述黃色陽離子染料包括羅丹明R18、TAMRA中的一種；所述反離子包括四苯基硼酸酯及其氟化類似物。

4.根據權利要求2所述的一種用于赭曲霉毒素A檢測的級聯FRET適配體傳感器，其特征在于，所述供體聚合物納米粒子或受體聚合物納米粒子的合成方法具體為：

將PMMA-AspN₃溶于乙腈中，在PMMA-AspN₃乙腈溶液中加入陽離子染料和反離子的復合鹽，500-1500rpm轉速下震蕩后快速加入合成緩沖液，超濾去除乙腈，用合成緩沖液洗滌三次，最終在超濾管中加入合成緩沖液超聲1～5min，復溶得到負載染料的供體聚合物納米粒子或受體聚合物納米粒子；

所述PMMA-AspN₃在乙腈中溶解的濃度為1～5mg/mL；

所述復合鹽溶于乙腈的濃度為0.5～1.5μg/μL；

所述合成緩沖液的成分包括10-50mM PBS或Tris，并包含10-200mM NaCl、0-30mMMgCl₂、0-30mM CaCl₂。

5.根據權利要求2所述的一種用于赭曲霉毒素A檢測的級聯FRET適配體傳感器，其特征在于，所述步驟(2)具體為：

在供體聚合物納米粒子上修飾OTA適配體的方法為：將ssDNA與供體聚合物納米粒子混合后，在25-50℃溫度下不攪拌避光反應5-24h，降至室溫；

在受體聚合物納米粒子上修飾cDNA和受體熒光基團的方法為：將修飾有DBCO基團的ssDNA、紅色熒光染料與受體聚合物納米粒子混合后，在25-50℃溫度下不攪拌避光反應5-24h，降至室溫；

所述供體聚合物納米粒子上修飾的ssDNA包括封閉DNA和OTA適配體，其中封閉DNA與OTA適配體比例為120:1-60:1之間；

所述受體聚合物納米粒子上修飾的ssDNA包括封閉DNA和cDNA，其中封閉DNA與cDNA比例為60:1-20:3之間；

所述受體聚合物納米粒子上修飾的受體熒光基團為熒光發射610nm的紅色熒光染料，包括Cy5-DBCO、ATTO647N-DBCO、ATTO665-DBCO或Cy5.5-DBCO，修飾的受體熒光基團的量為每個受體聚合物納米粒子上修飾1-60個。