[發明專利]登革病毒的PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202211046515.6
• 申請日: 2022-08-30
• 公開（公告）號: CN116479167A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 李凌云;代函鷹;周兆平;王曉紅
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 付海萍

本發明公開了一種登革病毒的PCR檢測方法，首先從待檢測樣本中提取登革病毒基因組RNA并純化，然后基于登革病毒的四種病毒毒株的5’?UTR共有一致性序列，設計用于逆轉錄的特異性環狀引物，并構建特異性逆轉錄環狀引物，其中，所述登革病毒的四種病毒毒株包括登革病毒1型毒株、登革病毒2型毒株、登革病毒3型毒株和登革病毒4型毒株；接著利用所述特異性逆轉錄環狀引物對所述登革病毒基因組樣本進行逆轉錄，獲得登革病毒的cDNA，最后對所述登革病毒的cDNA進行定量檢測。本發明的檢測方法可以在感染登革病毒各種標本(人血液標本、蚊蟲細胞或組織標本)中進行極早期檢測，提供人群感染登革病毒危險性評估和極早期預警。

技術領域

本發明基因檢測技術領域，特別涉及一種登革病毒的PCR檢測方法技術領域。

背景技術

登革熱(dengue?fever，DF)是由伊蚊(Aedes)傳播的、登革病毒(dengue?virus,DENV)感染引起的人類最嚴重的蟲媒傳染病，可引起登革熱(DF)、重癥登革熱和登革休克綜合征等。尤其是以高熱、嚴重出血、休克等為臨床癥狀的重癥登革熱，病死率較高。

由于全球氣候變暖、人口快速增長、人員流動性激增等因素，登革病毒感染的威脅正日趨嚴重，近幾十年全球登革熱發病率大幅度增長。據預測，全球50-60％的人口可能會面臨威脅，登革病毒感染已成為一個世界性的嚴重公共衛生問題，是世界衛生組織呼吁全球預警和應對?(Global?Alert?and?Response，GAR)的疾病之一。

登革病毒以伊蚊為傳播媒介，共有四種不同血清型毒株。目前認為：病毒的傳播途徑是由雌蚊叮咬帶有病毒血癥的登革熱患者或靈長類動物宿主，病毒在蚊蟲體內增殖8～10天后，再將病毒傳播給健康人，伊蚊宿主感染后無癥狀，但可終身攜帶和傳播病毒，并可經卵傳遞給后代。由此可見：伊蚊在登革病毒的傳播鏈條中處于中心的位置。所以，針對伊蚊感染登革病毒進行檢測將在極早期獲得疾病傳播的信息，將成為控制登革病毒在人群中傳播的極早期監控手段。

長期以來，在蚊蟲感染登革病毒的極早期，病毒的滴度非常低，需要靈敏度高、特異性強的檢測方法。登革病毒傳播的極早期方法非常欠缺，對登革病毒的檢測常常是疫情發生之后，即出現人群感染病例后檢測，使得對登革病毒的檢測常常處于被動和滯后的狀態，常用的檢測方法為：ELISA方法檢測病人血清中特異性的登革病毒抗體和登革病毒抗原；PCR方法檢測登革病毒的基因序列。而由于靈敏度、特異性問題，對于蚊蟲感染登革病毒的檢測方法相對欠缺，僅僅在人感染的流行區域對蚊蟲進行登革病毒基因PCR檢測，檢測主要針對登革病毒的結構基因——E(envelop)基因，靈敏度不高，無法用于登革病毒疫情極早期的預警檢測，也不能將四種病毒毒株一次性檢出。

發明內容

本發明的主要目的是提出一種登革病毒檢測方法，旨在解決現有技術中無法在登革疫情發生極早期進行檢測，從而進行預警監控，避免大范圍流行的技術問題。

為實現上述目的，本發明提出一種登革病毒的PCR檢測方法，所述登革病毒的PCR檢測方法包括以下步驟：

1)從待檢測樣本中提取登革病毒基因組RNA并純化，獲得登革病毒基因組樣本；

2)基于登革病毒的四種病毒毒株的5’-UTR共有一致性序列，設計用于逆轉錄的特異性環狀引物，并根據所述特異性環狀引物構建特異性逆轉錄環狀引物，其中，所述登革病毒的四種病毒毒株包括登革病毒1型毒株、登革病毒2型毒株、登革病毒3型毒株和登革病毒4型毒株；

3)利用所述特異性逆轉錄環狀引物對所述登革病毒基因組樣本進行逆轉錄，獲得登革病毒的cDNA；

4)對所述登革病毒的cDNA進行定量檢測，以得出登革病毒的濃度值，并根據所述濃度值判斷待檢測樣品是否感染登革病毒。

可選地，所述待檢測樣本包括血液、細胞和組織標本中的至少一種；