[發明專利]一種促植物側根發生發育有機提取物的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202211042426.4
• 申請日: 2022-08-29
• 公開（公告）號: CN115281217A
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發明（設計）人: 王建光;付堅;陳穗云;代瑾然;李妤;廖菊夠;焦夢婷;馬丹;唐菊
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: A01N63/36
• 分類號: A01N63/36;A01P21/00
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 雷丹

1.一種促植物側根發生發育的有機提取物的制備方法，其特征在于，包括以下制備步驟：

S1，青霉菌發酵物過100℃高溫烘干，加入10倍量的95％的甲醇常溫浸提24h，期間充分攪拌多次，回流提取3次，溫度50℃-70℃，過濾，合并濾液，濾液置旋轉蒸發儀減壓濃縮，干燥后得到青霉菌發酵物甲醇總提取物的浸膏；

S2，在S1所得浸膏中加入2-5倍質量的蒸餾水充分溶解，再加入等體積的乙酸乙酯充分混合后移入大型層析柱靜置12h，待溶液分成乙酸乙酯層、乳化層和水層后，棄乳化層和水層，收集乙酸乙酯層，將乙酸乙酯相裝入旋蒸瓶，30℃-50℃水浴鍋，減壓濃縮，真空干燥，得到青霉菌發酵物乙酸乙酯提取物的浸膏；

S3，將S2所得乙酸乙酯提取物浸膏用乙酸乙酯重新溶解后，上20cm×200cm的硅膠柱，樣品上柱后，用不同體積比的二氯甲烷和甲醇進行洗脫，分別收集不同比例的二氯甲烷和甲醇的餾分，每瓶收集150mL餾分，直至收集的洗脫液變為無色，每瓶餾分取5μL點GF254硅膠板，待樣品干后將硅膠板置于裝有飽和層析液的層析缸中展開，根據層析結果合并具有相同組分的餾分于旋蒸瓶中，40℃水浴鍋，減壓濃縮，真空干燥，得到的8組有機提取物，分別命名為E1、E2、E3、E7、E5、E6、E7、E8；

S4，將S3所得組分E7加適量甲醇溶解后，上6cm×150cm的硅膠柱，樣品上柱后，用二氯甲烷和甲醇進行洗脫，收集二氯甲烷:甲醇＝1:1的餾分，共收集60管，每管收集10mL餾分，合并10-40管餾分，40℃減壓濃縮，蒸干溶劑后，得到的青霉菌發酵物有機組分E7即為促植物側根發生發育的青霉菌發酵物的有機提取物。

2.根據權利要求1所述的一種促植物側根發生發育的有機提取物的制備方法，其特征在于，步驟S1中最佳溫度為60℃。

3.根據權利要求1所述的一種促植物側根發生發育的有機提取物的制備方法，其特征在于，步驟S2中最佳溫度為40℃。

4.根據權利要求1所述的一種促植物側根發生發育的有機提取物的制備方法，其特征在于，步驟S3與S4中分離硅膠的步驟為：

a、硅膠粉活化：將硅膠粉置于三角瓶中，用錫箔紙包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2-3h，冷卻后，用石油醚飽和，采用濕法裝柱；

b、樣品洗脫：樣品上柱后，采用逐漸增加洗脫劑極性的方法進行洗脫，洗脫劑的配比為二氯甲烷:甲醇＝12:1、5:1、1:1，分別收集不同比例的二氯甲烷和和甲醇的餾分，每瓶收集150mL餾分，直至收集的洗脫液變為無色；

c、薄層層析示蹤：將4cm×8cm的GF254硅膠板于110℃烘箱中活化2-3h，自然冷卻后取出，用玻璃毛細管吸取適量樣品，點于硅膠板基線上，用吹風機吹干溶劑后，置于裝有氯仿和甲醇的飽和層析液的層析缸中展開，待溶劑前沿展至距離薄層板頂端1cm時，取出，吹干溶劑，用紫外分析儀進行顯色。

5.根據權利要求4所述的一種促植物側根發生發育的有機提取物的制備方法，其特征在于，步驟a中所述硅膠粉粒徑為200-300目。

6.一種促植物側根發生發育的青霉菌發酵物的有機提取物的應用，其特征在于，將如權利要求1至5任一項所述方法制備得到的青霉菌發酵物的有機提取物應用于促植物側根發生發育，其最適濃度為10μg/mL。

7.一種促植物側根發生發育的青霉菌發酵物的有機提取物的應用，其特征在于，將如權利要求1至5任一項所述方法制備得到的青霉菌發酵物的有機提取物應用于誘導植物側根發生發育相關基因表達中。