[發(fā)明專利]可羥基化黃體酮C11α位的P450酶及其基因、表達(dá)載體、細(xì)胞及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211032704.8
• 申請日: 2022-08-26
• 公開（公告）號: CN116218798A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會;武勝;伏家強(qiáng);許正宏;王淑麗;史勁松;周金萍;王瓊堯
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);天津天藥藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/75;C12N1/21;C12P33/10;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明涉及一種可羥基化黃體酮C11α位的P450酶及其基因、表達(dá)載體、細(xì)胞及應(yīng)用，屬于酶工程技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。來源于原核微生物巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)H?1的黃體酮P450羥化酶CYP?BMH3及其基因序列cyp?bmh3，該基因全長1233bp，編碼410個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，基因序列如SEQ?ID?NO.2所示；并基于該酶的異源表達(dá)實(shí)現(xiàn)了黃體酮的高效轉(zhuǎn)化，同時(shí)專一性高，減少反應(yīng)副產(chǎn)物，降低了生產(chǎn)成本，為其進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶基因工程及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可羥基化黃體酮C11α位的P450酶及其基因、表達(dá)載體、細(xì)胞及應(yīng)用。

背景技術(shù)

孕酮(progesterone)，亦被稱為黃體酮、孕甾酮、黃體甾酮、助孕激素、助孕素、黃體素或助孕酮，其縮寫為P4，全稱孕甾-4-烯-3,20-二酮，是一種內(nèi)源性類固醇和孕激素性激素，也是在體內(nèi)的主要孕激素，由女性的卵巢分泌。黃體酮是由卵巢黃體細(xì)胞分泌的一種含有21個碳原子的類固醇激素，也是合成一切類固醇激素的中間產(chǎn)物，屬于孕激素之一。有兩種晶型，即α-型和β-型，兩種晶型有類似的生理活性，α-型是從稀乙醇中析出，為正交晶系白色棱柱狀結(jié)晶，β-型為正交晶系白色針狀結(jié)晶，二者均不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等。自然界中，黃體酮廣泛存在于動物體內(nèi)，有維持雌性動物的妊娠，促進(jìn)子宮粘膜層增厚、腺體的彎曲度以及分泌機(jī)能的增加等生理功能。甾醇的羥基化反應(yīng)是指在有機(jī)分子上引入羥基的反應(yīng)，甾體類化合物通過羥基化修飾后，一般會表現(xiàn)出更好的藥理活性，常見的羥基化黃體酮藥物中間體有11α-OH-黃體酮，作為黃體酮最重要的羥化中間體之一，11α-OH-黃體酮又被稱為11α-OH-孕酮，分子式為C₂₁H₃₀O₃，相對分子質(zhì)量為330.46，報(bào)道稱其可以選擇性地抑制11β-羥基類固醇脫氫酶II，這是一種在調(diào)節(jié)腎臟電解質(zhì)平衡中很重要的酶，它能將人體內(nèi)的皮質(zhì)醇代謝成腎上腺皮質(zhì)酮，因此，11α-OH-黃體酮可以影響血壓調(diào)節(jié)。此外，11α-OH-黃體酮具有抗雄激素活性，對雌激素和孕激素副作用較小，所以在臨床應(yīng)用研究領(lǐng)域具有很大的潛力。

11α-OH-黃體酮的制備方法包括化學(xué)法和生物法。化學(xué)法合成11α-OH-黃體酮的合成路線是以11α-乙酰黃體酮為原料，通過多步縮合，開環(huán)和異構(gòu)化等反應(yīng)獲得11α-OH-黃體酮，該過程反應(yīng)步驟多、轉(zhuǎn)化率低，且分離純化過程復(fù)雜。1952年，Peterson和Murray首次發(fā)現(xiàn)黑根霉(Rhizopusnigricans)對甾體具有C-11α羥化能力，從而使黃體酮到皮質(zhì)酮的合成縮短為三步，收率達(dá)90％，從此解決了可的松等皮質(zhì)激素類化合物合成的難題，由此開創(chuàng)了微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物的先例。

目前關(guān)于黃體酮微生物羥基轉(zhuǎn)化的研究非常廣泛，如黃竹梅(黃體酮和環(huán)氧黃體酮微生物羥基轉(zhuǎn)化的研究,四川師范大學(xué),2013.DOI:10.7666/d.Y2301348.)使用新月彎孢霉和藍(lán)色犁頭霉菌分別對黃體酮進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液經(jīng)萃取、濃縮，獲得產(chǎn)物粗產(chǎn)品，再通過硅膠柱層析分離純化，發(fā)現(xiàn)黃體酮的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中含有11α-OH-黃體酮；專利CN202110142291.8公開了一種利用固定化羥化酶轉(zhuǎn)化制備11α,17α-羥基黃體酮的方法，以17α-OH-黃體酮為底物制備11α,17α-OH-黃體酮；專利CN202010405130.9公開了一種11α-羥化酶突變體，基于該突變體構(gòu)建的重組畢赤酵母可轉(zhuǎn)化底物黃體酮為11α-OH-黃體酮。但以上針對黃體酮微生物羥基轉(zhuǎn)化的方法多是利用真菌等真核體系進(jìn)行生物催化，真菌催化雖然轉(zhuǎn)化效率良好，但其遺傳特性不清晰，分子操作體系不完善，且轉(zhuǎn)化過程中伴隨諸多副產(chǎn)物，不利于下游產(chǎn)物高效分離等工作的進(jìn)行，而對于細(xì)菌等原核體系，隨著近些年生物技術(shù)的飛速發(fā)展，其遺傳操作體系已非常成熟，因此需要尋找一種新的利用原核生物體系制備11α-OH-黃體酮的方法。

發(fā)明內(nèi)容