[發(fā)明專利]有機溶劑耐受性提高的鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211032106.0
• 申請日: 2022-08-26
• 公開（公告）號: CN115820598A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設計）人: 孫彥;吳垠;董曉燕;史清洪
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/70;C12N15/55
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

本發(fā)明是有機溶劑耐受性提高的鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體及其應用，鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體包括E16R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.3；E121R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.4；E16R/E93R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.5；E16R/E121R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.6；E93R/E121R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.7；E16R/E93R/E121R/E257R，氨基酸序列SEQ IDNO.8。本鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體應用提高有機溶劑半衰期至100?385分鐘、提高有機溶劑耐受性至2.5?4.9倍。

技術領域

本發(fā)明涉及鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體及其應用，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

因為自身的功能性和特殊性，酶在食品、醫(yī)藥、生物燃料、化工原料及相關領域具有重要的應用價值。此外，酶在生物催化合成手性化學品方面也起著至關重要的作用。酶促反應具有選擇性高、環(huán)境友好、反應條件溫和、反應步驟簡單等優(yōu)點，因此逐漸取代了傳統(tǒng)化學反應在催化體系中的應用。雖然酶在生物催化合成中具有巨大的潛力，但是天然酶存在催化活性低、穩(wěn)定性差、底物范圍有限、反應選擇性低等問題。解決這些問題最有效的兩種方法是在不同環(huán)境中篩選具有特定功能的新型酶或改造現(xiàn)有酶獲得所需的特定功能。與篩選新酶相比，在分子水平上改造天然酶相對簡單，蛋白質工程由此應運而生。蛋白質工程是改造酶結構以保證酶功能變化的有力工具，被廣泛應用于提高酶的特異性、區(qū)域選擇性和立體選擇性，以及酶的熱穩(wěn)定性和有機溶劑耐受性。許多蛋白質設計策略(包括隨機進化、半理性設計和理性設計)已經(jīng)在漫長的歷史進程中被構想出來。

鹵代烷脫鹵酶屬于α/β水解酶家族，能夠在多種氯化、溴化和碘化底物中催化碳-鹵鍵的裂解。鹵代烷脫鹵酶的底物(鹵代烷烴或鹵代酰胺)和產(chǎn)物(鹵代醇、醇、二醇或羥基酰胺)都是有機與藥物合成的重要組成部分，因此被廣泛應用于生物催化、生物修復、生物傳感和細胞成像等領域。作為鹵代烷脫鹵酶中的一種特殊酶，DhaA不僅能夠實現(xiàn)穩(wěn)定存在的高毒性工業(yè)副產(chǎn)物1,2,3-三氯丙烷的有效降解，還可以降解致命化學武器芥子氣。因為DhaA的疏水性底物在水中的溶解度低，所以必須向反應體系中添加有機助溶劑。但是反應混合物中有機助溶劑的存在會引起酶分子柔性喪失、酶分子變性而導致酶的快速失活。DhaA在實際生產(chǎn)過程中的廣泛使用受限于惡劣條件下的低穩(wěn)定性和低活性，因此提高DhaA在惡劣條件下的催化性能成為一個亟待解決的問題。

目前通過蛋白質工程提升鹵代烷脫鹵酶DhaA有機溶劑耐受性的方法主要為定向進化，并且突變位點主要位于底物結合口袋附近。隨機進化是蛋白質工程中提高穩(wěn)定性最常用的方式，但是隨機進化的缺點也比較明顯，比如突變文庫容量通常較為龐大、陽性突變較少、篩選較為困難，需要消耗大量的人力、資源和金錢。生物技術與計算機技術的結合使得人們對于蛋白質結構和功能的關系有了更加全面系統(tǒng)的認識?；诮Y構分析或序列比對的單個或多個關鍵殘基的突變可以提高酶的穩(wěn)定性，從而大大簡化了實驗任務。本發(fā)明采取一種計算機輔助的蛋白質表面設計策略，獲得了有機溶劑耐受性提高的鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供了鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體及其應用，本發(fā)明提供的鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體有機溶劑耐受性有了顯著的提升。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明的鹵代烷脫鹵酶DhaA突變體，包括：E16R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.3；E121R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.4；E16R/E93R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.5；E16R/E121R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.6；E93R/E121R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.7；E16R/E93R/E121R/E257R，氨基酸序列SEQ ID NO.8。