[發明專利]一種高對比度真菌熒光染色液及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202211028952.5
• 申請日: 2022-08-26
• 公開（公告）號: CN115420579A
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 潘再法;韓夢琪;劉善娣
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;黃競云

本發明公開了一種高對比度真菌熒光染色液的制備與應用。所述真菌熒光染色液分為A、B液，其中A液包括：熒光素、防淬滅劑、保濕劑、軟化劑、通透劑和促溶劑等；B液包括：背景熒光染料和防腐劑等。本發明真菌熒光染色液能與真菌細胞壁有效結合，將真菌染成明亮藍色，將樣本背景染成暗紅色，顯著增大藍色真菌與紅色背景的對比度。同時，本熒光染色液能夠大大提高真菌的判讀效率以及準確率，降低檢測人員操作難度，且區分A、B液儲存有利于染色液長期保持優良染色效果。

技術領域

本發明屬于微生物熒光染色技術領域，具體涉及一種高對比度真菌熒光染色液及其制備方法與應用。

背景技術

近年來，隨著抗生素、免疫抑制劑等藥物的廣泛應用，由真菌引起的感染日益普遍。白念珠菌是最常見的條件致病性共生真菌之一，是健康人體微生物群的一部分，存在于宿主的口腔、表皮、胃腸道及陰道等處。對于免疫低下患者而言，念珠菌感染后病情發展快，在國內綜合醫院感染病死率達37.7％。并且與其他微生物感染相比，白色念珠菌擁有細胞壁結構，無特異性臨床表現，極易導致漏診誤診，耽誤疾病的治療。因此對白念珠菌感染的早期準確鑒定對于臨床給藥治療以及流行病學研究有著重要意義。

傳統的真菌診斷方法主要包括蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)法、六胺銀染色(GMS)法、碘酸雪夫氏染色(PAS)法、KOH濕片鏡檢法、真菌分離培養法以及熒光染色(CFW)法。一般染色法步驟較多，操作復雜，對檢測人員要求較高，陽性檢出率低；KOH濕片鏡檢法特異度和靈敏度均較低，背景干擾強，對檢測人員技術水平要求較高，易存在漏診錯診的問題；真菌分離培養法特異度高，能分辨菌屬，但取材要求高檢測周期長，存在假陽性。

熒光染色法是一種較為常見的真菌快速檢測方法，大部分已投入使用的熒光染色液主要成分為熒光素、促溶劑和降背景染料等。熒光素能與真菌細胞壁特異性結合，在一定波長光的激發下結合了熒光素的真菌能夠產生藍色熒光，使得真菌被快速檢出。此方法特異性較高，對操作人員技術水平要求低，周期短，陽性檢出率高且不容易錯檢，因此成為了最常用的真菌檢測方法之一。

現已投入市場應用的真菌熒光染色液大部分采用熒光增白劑作為熒光素，真菌能夠在紫外光的激發下產生明亮藍色熒光。然而，大部分熒光染色液采用伊文思藍、溴酚藍等能夠吸收部分背景熒光的降背景試劑。但用采用該原理的染色液染色后，送檢的人體皮屑、甲屑組織仍呈現藍色，真菌呈現明亮藍色，背景干擾強，較難區分。也有如專利CN111019999A公開的一種微生物熒光染色液，使真菌呈藍色、綠色或紅色，雖能有效檢出真菌，但存在與背景對比度低的不足，容易造成漏檢。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明要解決的技術問題是提供一種高對比度真菌熒光染色液的制備與應用。本發明的目的是通過加入背景熒光染料，將皮屑、甲屑樣本上皮細胞等組織染成暗紅色，而真菌仍呈顯明亮藍色。增強藍色真菌與紅色背景的對比度，有利于檢測人員快速判別真菌。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:

一種高對比度真菌熒光染色液，所述真菌熒光染色液由A液和B液組成，其中，所述A液包括終濃度為50-500mg/L(優選100-200mg/L，特別優選100-150mg/L)的熒光素，溶劑為水，所述的熒光素為熒光增白劑28、熒光增白劑367、熒光增白劑220、熒光增白劑85中的一種或兩種以上的混合物；所述B液包括終濃度為1-100mg/L(優選70-100mg/L)的背景熒光染料，溶劑為水，所述背景熒光染料為中性紅、羅丹明B、赤蘚紅、Cy5、藏花紅T、DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)、DiD(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine,4-ChlorobenzenesulfonateSalt)中的一種或兩種以上的混合物。