[發明專利]一種無核酸擴增的單分子RNA定量檢測方法及系統

有效

• 申請號: 202211021369.1
• 申請日: 2022-08-24
• 公開（公告）號: CN115386658B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 王輝;李正平;陳德勝;王洪紅;梁源文
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/06;C12R1/93
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 岳野

本發明提供了一種無核酸擴增的單分子RNA定量檢測方法及系統，包括：S1：制備單鏈RNA熒光報告探針功能化修飾的微球；S2：設計靶標RNA特異性的crRNA；S3：將已知濃度的靶標RNA、crRNA、Cas13蛋白、反應緩沖溶液和S1制備微球在適宜的溫度下共同孵育；S4：將S3孵育后的微球進行熒光成像，建立微球熒光強度和RNA濃度之間線性對應關系；S5：利用S4建立的線性對應關系對樣品中RNA定量檢測。本發明所述的RNA檢測方法可實現單分子水平RNA定量分析，無需逆轉錄及核酸預擴增步驟，檢測條件溫且操作步驟簡單，為RNA診斷分析提供了一種高靈敏度簡便、通用新策略。

【技術領域】

本發明涉及分子診斷與生化分析方法研究領域，尤其涉及一種無核酸擴增的單分子RNA定量檢測方法及系統。

【背景技術】

作為重要的遺傳物質，RNA各個生物過程中的發揮至關重要作用，從基礎生物學研究到分子生物學探索再到臨床診斷分析，高靈敏度、高特異性的RNA檢測顯得越來越重要。例如，基于新型冠狀病毒?(SRAS-CoV-2)基因組RNA的核酸檢測，作為新型冠狀病毒病(COVID-19)?診斷的金標準，在COVID-19的預防和控制中發揮著至關重要的作用；再如，由染色體重排所形成的融合基因轉錄本RNA，被國家綜合癌癥網絡腫瘤學臨床實踐指南(National?Comprehensive?Cancer?Network?Clinical?Practice?in?Guidelines?inOncology，NCCN指南)和世界衛生組織藍皮書(WHO?Blue?Books)作為各類癌癥分類、診斷、治療、預后和微小殘留灶監測的分子標志物。

目前，RNA檢測主要依賴于核酸擴增技術，包括逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，連接酶鏈式反應(LCR)，重組酶擴增技術(RPA)，環介導等溫核酸擴增(LAMP)等等。由于高效的指數擴增機制，這些方法獲得了非常高的靈敏度，甚至達到了單分子水平。然而，這些方法通常需要逆轉錄/連接步驟以將RNA轉化為DNA，以及隨后的DNA復制步驟以產生可檢測的核酸水平。但擴增步驟往往會引入一些比較棘手的問題，例如由于逆轉錄不完全導致的目標RNA分子丟失、易錯序列復制導致的擴增偏差以及污染導致的假陽性結果。此外，需要精心設計多個靶標特異性探針/引物，使用多種工具酶，需要嚴格優化實驗條件。因此，迫切需要發展一種通用RNA定量檢測方法，該方法不僅具有核酸擴增技術一樣的靈敏度，而且避免了上述核酸擴增所存在的問題。

研究發現CRISPR/Cas13a系統具有靶標依賴性反式切割活性，它能夠通過crRNA對靶標RNA進行特異性識別并與之結合，并激活它的反式切割活性，Cas13a的反式切割活性能夠高效地水解周圍環境中存在的單鏈RNA報告探針，由此實現無擴增的RNA檢測。雖然CRISPR/Cas13a系統具有多重響應機制，但只能檢測pM以上的RNA，無法滿足大多數實際樣本分析需求。最近，研究人員通過串聯的CRISPR/Cas系統和設計多?crRNA?CRISPR/Cas13a系統，使無擴增RNA分析的靈敏度提高到了fM水平，但這無疑增加分析成本，使設計復雜化；即便如此，仍然無法滿足?aM水平的RNA定量檢測。

【發明內容】

鑒于此，本發明提供了一種通用、簡便的無核酸擴增單分子RNA定量檢測方法。

本發明所提供RNA定量檢測方法包括以下步驟：

S1：制備單鏈RNA熒光報告探針功能化修飾的微球；

S2：設計合成靶標RNA特異性的crRNA；

S3：將已知濃度的靶標RNA、crRNA、Cas13蛋白、反應緩沖溶液和?S1制備微球在適宜的溫度下共同孵育；

S4：對S3孵育后的微球進行熒光成像，建立微球熒光強度和RNA濃度之間線性對應關系；

S5：利用S4建立的線性對應關系，對樣品中RNA定量檢測。