[發明專利]單微球空間限域增強的CRISPR/Cas12a傳感系統及其應用

有效

• 申請號: 202211020049.4
• 申請日: 2022-08-24
• 公開（公告）號: CN116144738B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 王輝;李正平;王洪紅;王淑慧;梁源文
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 岳野

本發明提供了一種單微球空間限域增強的CRISPR/Cas12a傳感系統及其應用，所述傳感系統包括：單微球空間限域增強反應器和CRISPR/Cas12a體系，所述單微球空間限域增強反應器包括單微球和單鏈DNA熒光報告探針；所述單微球用于增加局部分子濃度、促進CRISPR/Cas12a反式切割反應效率和負載單鏈DNA熒光報告探針；所述單鏈DNA熒光報告探針用于輸出熒光信號；所述CRISPR/Cas12a體系用于特異性識別Activator?DNA和通過反式酶切活性水解負載在單微球表面的單鏈DNA熒光報告探針，在單微球表面產生熒光信號；所述單鏈DNA熒光報告探針固定在單微球外表面，所述CRISPR/Cas12a體系反式切割反應在單微球空間限域增強反應器表面進行本發明設計簡單、無需核酸擴增就可以實現單分子水平目標DNA定量檢測。

【技術領域】

本發明涉及生物標志物分子傳感，分子診斷及生化分析研究領域，尤其涉及一種單微球空間限域增強的CRISPR/Cas12a傳感系統及其應用。

【背景技術】

成簇規則間隔的短回文重復序列(CRISPR)和CRISPR輔助蛋白(Cas)組成的CRISPR/Cas是原核生物一種天然的適應性免疫系統，用來抵抗外源遺傳物質的入侵。該系統目前已經成為分子生物學領域最強大的技術之一，由于該系統特異性靶向作用和可編程性而被廣泛應用于基因編輯。最近，研究發現CRISPR/Cas系統具有靶標依賴的核酸內切酶活性(也稱為側向切割活性或反式切割活性)，尤其是CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas12系統，為新一代基于CRISPR/Cas系統的核酸診斷平臺的開發提供新機遇。在典型的CRISPR/Cas系統中，采用CRISPR?RNA(crRNA)來指導Cas蛋白特異性識別目標核酸并利用其順式切割活性切割目標核酸，同時激活核酸內切酶活性，該活性可以切割周圍環境中單鏈DNA(CRISPR/Cas12系統)或單鏈RNA(CRISPR/Cas13系統)熒光或電化學或比色報告探針，從而能夠開發各種新生傳感平臺。

盡管具有CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas12反式切割反應具有多重響應特征，但大多數已報道的CRISPR/Cas診斷平臺，如SHERLOCK、HOLMES、DETECTR、SHINE、MeCas12a、CARMEN和PECL-CRISPR等仍然依賴于聚合酶鏈式反應(PCR)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、等溫指數擴增(EXPAR)、滾環擴增(RCA)和環介導的等溫擴增(LAMP)等。這些核酸擴增技術與CRISPR/Cas系統的智能整合，使得這些新興方法能夠以超高靈敏度檢測低至10^-18M(aM)水平的核酸分子，并具有出色特異性來區分單核苷酸差異。然而，由于核酸擴增系統和CRISPR/Cas系統最佳反應溫度的差異，這些方法往往需要單獨的擴增步驟和實驗操作，這使得檢測方法的適應性變差，同時增加擴增產物交叉污染導致假陽性結果的風險。其次，這些非線性擴增過程通常會迅速達到平臺期，這限制了在寬動態范圍內量化目標核酸以預測和/或監測疾病狀態和發展的能力。此外，嚴格的設計多個目標特異性引物、仔細優化實驗條件和其他蛋白質(DNA聚合酶、或/和切口酶、或/和重組酶、或/和單鏈結合蛋白)是必不可少的，這使測量過程復雜化并延長了周轉時間。最后，擴增過程可能會產生非特異性擴增產物，并極大地挑戰CRISPR/Cas系統的特異性。