[發明專利]一種基于反向PCR技術驗證基因敲除轉化子的方法

在審

• 申請號: 202211008909.2
• 申請日: 2022-08-22
• 公開（公告）號: CN115341018A
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 崔國兵;鄧懿禎;袁梅婷;尹凱
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

1.一種基于反向PCR技術驗證同源重組基因敲除轉化子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.通過目的基因檢測引物檢測經基因同源重組原理獲得的基因敲除轉化子是否含有目的基因；

S2.隨機挑選不含目的基因的轉化子進行搖菌培養，離心收集菌體，提取基因組DNA；

S3.在同源重組的抗性基因標簽上設計反向PCR擴增引物，再在反向PCR擴增引物設計位點外側的序列上選取相同的限制性內切酶位點，要求一側的限制性內切酶位點位于其中一個同源臂附近的基因組上，另一側的限制性內切酶位點位于抗性基因標簽上，且在反向PCR擴增引物設計位點內側的序列上不存在該相同的限制性內切酶位點；

S4.采用步驟S3選取的限制性內切酶對步驟S2的基因組DNA進行消解，消解后對限制性內切酶失活處理，再用DNA連接酶連接成環狀DNA分子；

S5.以步驟S4連接后的環狀DNA分子為模板，采用步驟S3設計的反向PCR擴增引物進行PCR擴增反應，將PCR產物電泳檢測，若擴增條帶與預設大小一致，則判定敲除成功，反之，則判定敲除不成功。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟S4 DNA消解為將基因組DNA在含限制性內切酶的消解體系中36℃～38℃孵育3～5小時。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟S4 DNA消解為將基因組DNA在含限制性內切酶的消解體系中37℃孵育3～5小時。

4.根據權利要求2或3所述方法，其特征在于，所述消解體系為基因組DNA1μg，限制性內切酶1μL，cutsmart buffer 3μL，ddH₂O補至30μL。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟S4對限制性內切酶失活處理采用熱失活的方式。

6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟S4所述DNA連接酶為T4-DNA連接酶。

7.根據權利要求6所述方法，其特征在于，DNA連接酶連接體系為T4 DNA連接酶1μL，T4-DNA連接酶緩沖液2μL，DNA消解產物10μL，ddH₂O補至20μL。

8.根據權利要求6所述方法，其特征在于，DNA連接酶連接條件為15～17℃孵育6～12h。

9.根據權利要求1所述方法，其特征在于，要求選擇的限制性內切酶位點使酶切、連接環狀后的DNA分子不超過4kb。

10.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述基因敲除轉化子為甘蔗鞭黑粉菌基因敲除轉化子。