[發明專利]一種甘蔗鞭黑粉菌菌絲體的培養方法及其應用

在審

• 申請號: 202211008908.8
• 申請日: 2022-08-22
• 公開（公告）號: CN115340954A
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 崔國兵;鄧懿禎;袁梅婷;尹凱;畢新萍
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/02;C12Q1/18;C12R1/645
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發明公開了一種甘蔗鞭黑粉菌菌絲體的培養方法，包括如下步驟：S1.挑取活化好的不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子進行培養，獲得甘蔗鞭黑粉菌擔孢子母液；S2.將步驟S1的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子母液離心棄上清，無菌水重懸，離心，棄上清，再用無菌水重懸并調節擔孢子液OD₆₀₀至0.8～1.2，獲得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子液；S3.將不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子液等體積混勻，取混合液滴至PDA固體培養基上，于26～30℃培養6～8天，即獲得甘蔗鞭黑粉菌初生菌絲體。本發明培養獲得的初生菌絲體可彌補目前甘蔗鞭黑粉菌研究上存在的不足，可用于甘蔗鞭黑粉菌環境脅迫和生防菌篩選等方面的研究。

技術領域

本發明涉及微生物培養技術領域，更具體地，涉及一種甘蔗鞭黑粉菌菌絲體的培養方法及其應用。

背景技術

甘蔗是重要的經濟作物之一，其種植面積占總糖料作物種植面積的90％以上。甘蔗病害尤其是真菌性病害嚴重影響甘蔗的田間產量，其中以甘蔗鞭黑穗病造成的危害最嚴重。經鑒定，甘蔗鞭黑穗病病原菌為擔子菌亞門黑粉菌屬甘蔗鞭黑粉菌(Sporisoriumscitamineum，Ss)。甘蔗鞭黑粉菌的生活史分生活史可分為3個不同的階段：單倍體酵母樣擔孢子、雙核菌絲和二倍體冬孢子。其中單倍體擔孢子不具備侵染甘蔗的能力，而由不同交配型單倍體進行有性配合后形成的雙核菌絲體具有致病性，能穿透植物組織進行侵染。侵染菌絲吸取寄主體內的營養物質并隨著蔗株生長點向上生長而逐漸向上蔓延，最終在蔗稍抽出黑鞭，黑鞭中充滿大量的冬孢子。病菌冬孢子可隨氣流、雨水等媒介進行遠距離傳播，亦可落入土壤長期存活。冬孢子在適宜的環境條件下萌發出長短不一的擔子，每個擔子細胞又可以產生1至數個單倍體擔孢子，異型擔孢子經有性配合后形成菌絲可再次侵染蔗株完成再侵染。

由于甘蔗鞭黑粉菌擔孢子為單倍體，不具有致病性，而其經有性配合后形成具有侵染能力的雙核菌絲。因此，有性配合是甘蔗鞭黑粉菌致病性的關鍵過程之一。近年來，其復雜的有性配合分子調控機制被逐漸解析，為依賴cAMP和MAPK途徑的信號通路。具體的：交配型等位基因a位點編碼信息素被其相對性別受體蛋白Pra1/2識別，經由受體蛋白將信號傳遞至胞內。由cAMP和MAPK途徑逐級傳遞至全局調控因子Prf1，進而影響交配型等位基因b位點表達從而完成有性配合。由于甘蔗鞭黑粉菌從侵染甘蔗到發病有著較長的潛伏期且發病前病狀不容易被察覺使得甘蔗黑粉病不容易被有效的防治。因此深入研究其致病機理，可以為有效防治甘蔗黑粉病提供理論基礎。例如中國專利CN108552205A公開了法尼醇在防治黑粉病中的用途、中國專利CN106942230A公開了法尼醇在防治黑粉病中的用途、中國專利CN105925498A公開了假單胞菌屬菌株ST4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的應用，目前現有技術中針對甘蔗鞭黑粉菌的研究主要是研究其擔孢子及二態型轉變。由于缺乏甘蔗鞭黑粉菌菌絲體的培養方法，使得甘蔗鞭黑粉菌菌絲侵染作為侵染甘蔗的直接途徑的相關研究并未展開，導致影響甘蔗鞭黑粉菌絲生長及其致病性的分子機制鮮有報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述缺陷和不足，提供一種甘蔗鞭黑粉菌菌絲體的培養方法，所述方法可有效分離并培養甘蔗鞭黑粉菌菌絲體。彌補目前甘蔗鞭黑粉菌僅研究擔孢子及二態型轉變存在的不足，并成功應用于甘蔗鞭黑粉菌環境脅迫和生防菌篩選等方面的研究。

本發明的第二個目的在于提供分離獲得的甘蔗鞭黑粉菌初生菌絲體在甘蔗鞭黑粉菌環境脅迫和生防菌篩選中的應用。

本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

一種甘蔗鞭黑粉菌菌絲體的培養方法，包括如下步驟：

S1.分別挑取活化好的不同交配型(+、-)的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子進行培養，獲得甘蔗鞭黑粉菌擔孢子母液；

S2.將步驟S1獲得的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子母液離心棄上清，無菌水重懸，離心，棄上清，再用無菌水重懸并調節擔孢子液OD₆₀₀至0.8～1.2，獲得不同交配型(+、-)的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子液；