[發(fā)明專利]一種高活性O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶基因制備濱蒿內(nèi)酯的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211005459.1
• 申請日: 2022-08-22
• 公開（公告）號: CN116064607A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁偉;郭富友;肖慶禮;周紅;王建林;楊亮;萬鳳琳;簡渝凡;任檸
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學(xué);重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京中政聯(lián)科專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11489
• 代理人: 曲晶晶

1.一種高活性O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，其特征在于，所述O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.一種高活性O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，所述O-甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ?IDNO.3所示。

3.一種重組表達(dá)載體，由空載體和插入該空載體的目的基因組成，其特征在于，所述目的基因為權(quán)利要求1所述的O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因。

4.一種重組菌，其特征在于：所述重組菌含有權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，或在基因組上整合了SEQ?ID?NO.2所示的基因。

5.權(quán)利要求1所述O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、權(quán)利要求2所述、權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體或權(quán)利要求4所述重組菌在制備濱蒿內(nèi)酯中的應(yīng)用。

6.一種高活性O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)、將權(quán)利要求1所述的基因構(gòu)建到載體中；再轉(zhuǎn)化到宿主菌株中，得到重組表達(dá)菌株；

2)、將步驟1)重組表達(dá)菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入IPTG誘導(dǎo)，發(fā)酵完畢，得可溶性重組的O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白。

7.一種高活性O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶基因制備濱蒿內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述方法為：根據(jù)權(quán)利要求1所述O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體或權(quán)利要求4所述重組菌利用生物工程制備得到O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白，再以東莨菪內(nèi)酯為底物，催化得到濱蒿內(nèi)酯。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，具體的方法1為：將構(gòu)建有SEQ?ID?NO.2所示基因的重組菌接種于TB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)4h后，分階段向培養(yǎng)基中添加?xùn)|莨菪內(nèi)酯，培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，上清液含有催化后的濱蒿內(nèi)酯；

或者，具體的方法2為：將構(gòu)建有SEQ?ID?NO.2所示基因的重組菌接種于TB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束；取菌株細(xì)胞體進(jìn)行高壓均質(zhì)破碎，破碎后收集裂解液的上清液，得到含有OMT_Syn蛋白的粗酶液；將OMTSyn蛋白、S-腺苷-L-甲硫氨酸和東莨菪內(nèi)酯一起30℃反應(yīng)1-4小時，得濱蒿內(nèi)酯。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，具體的方法2中，OMTSyn蛋白為含有OMT_Syn蛋白的粗酶液，或者含有OMT_Syn蛋白的粗酶液進(jìn)一步純化得到的OMT_Syn蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，構(gòu)建有SEQ?ID?NO.2所示基因的重組菌的具體制備方法為：用引物分別擴增SEQ?ID?NO.2所示的基因和空載體質(zhì)粒，再DNA回收試劑盒回收目標(biāo)片段，通過Gibson組裝，整合在空載體質(zhì)粒的EcoRI/NotI位置，獲得重組質(zhì)粒；再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌株中，得到重組表達(dá)菌株。