[發明專利]一種煙酰胺核糖激酶突變體、編碼基因及應用

在審

• 申請號: 202211004786.5
• 申請日: 2022-08-22
• 公開（公告）號: CN115725538A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 程峰;吳曉虎;薛亞平;李可欣;沈其;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/30;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種煙酰胺核糖激酶突變體、編碼基因，含有編碼基因的載體、基因工程菌及應用。本發明針對野生型NrK，通過大分子建模技術模擬NrK的三維結構，利用能量最低原理和分子對接技術預測出可能的與催化相關的一個或多個位點。本發明構建的煙酰胺核糖激酶突變體與野生型酶相比，酶活力提高了1.26～2.98倍，能顯著降低酶的使用量，降低發酵容量和成本；且能極大縮短反應時間，提高NMN收率，能夠滿足采用生物酶法制備NMN的大規模工業化生產的需求，具有廣泛的應用前景。

(一)技術領域

本發明涉及一種煙酰胺核糖激酶突變體、編碼基因，含有編碼基因的載體、基因工程菌及應用。

(二)背景技術

煙酰胺單核苷酸(Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是一種自然存在的生物活性核苷酸，NMN有2種不規則存在形式，α異構體和β異構體。其中，β異構體是NMN的活性形式，分子量為334.221g/mol。NMN是哺乳動物體內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadenine dinucleotide，NAD⁺，又稱輔酶I)合成途徑的重要中間體。近年來在Science、Nature、Cell等國際權威學術雜志上的相關研究報道表明，補充NMN可有效地增加和恢復體內輔酶I水平，大幅延緩衰老和防止老年癡呆癥等多種神經元退化疾病，并由此從根本上調理和改善衰老的各種癥狀。因此以NMN為活性成分的功能性保健食品有著很大的開發潛力和市場前景。目前NMN在歐、美、日等發達國家已批準作為保健食品原料，并以NMN為主要成份開發出多種保健品，如美國HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LABNMN3000膠囊等。

NMN目前的生產方法主要有三種：固態酵母發酵工藝、體外酶催化工藝和化學法合成工藝。其中：(1)固態酵母發酵工藝復雜，產量較低，因此產品價格高昂。(2)化學法合成工藝以煙酰胺核糖為原料，用三氯氧磷進行磷酸化得到。雖然技術容易控制，但產品中雜質過多，分離純化困難且總體收率很低；同時有機溶劑使用量大，對環境污染不可忽視。(3)酶作為一類與化學合成互補的、高效的生物催化劑已被廣泛應用于新藥研發、食品、化工等領域。目前主流的NMN生產工藝都是采用安全綠色的體外酶催化工藝。

而NMN的生物酶法制備主要有兩條途徑。第一條是以D-核糖和煙酰胺為起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和煙酰胺磷酸核糖轉移酶等的作用下，經過三步催化反應得到NMN。該條路線底物轉化率不高，且中間產物較多，后續分離純化較困難，因而總體收率偏低，導致生產成本高。第二條路線是以煙酰胺核糖(nicotinamide riboside，NR)為起始原料，在煙酰胺核糖激酶(NR kinase，NrK)和ATP的作用下，一步反應得到NMN，收率高，產品純度高，未來將成為NMN的主流生產方法。

然而目前關于煙酰胺核糖激酶的研究仍然較少，限制了生物酶催化一步反應法制備NMN工業化生產中的應用。通過定向突變方法提高煙酰胺核糖激酶的酶活性，將十分有助于實現工業上減少酶量，降低生產成本。

(三)發明內容

本發明的目的是提供一種活性提高的煙酰胺核糖激酶突變體、編碼基因，含有編碼基因的載體、基因工程菌及應用，以解決現有NMN制備方法原料成本較高且野生型煙酰胺核糖激酶活性不理想，難以實現工業化生產的問題。

本發明采用的技術方案是：

一種煙酰胺核糖激酶突變體，由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第10位、第12位、第38位、第55位、第102位進行單突變或多點聯合突變獲得。

來源于Homo sapiens的野生型煙酰胺核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。