[發明專利]GCK基因突變的細胞模型及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202210993390.1
• 申請日: 2022-08-18
• 公開（公告）號: CN115725653A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 樊高威;王清濤
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N5/09;C12N5/071;C12N15/113;C12Q1/02
• 代理公司: 北京八月瓜知識產權代理有限公司 11543
• 代理人: 袁曉雨

本發明涉及生物技術技術領域，尤其是涉及一種GCK基因突變的Hela細胞模型及其構建方法和應用，其中，構建方法包括以下步驟：針對GCK基因需要突變的目的基因位點，設計gRNA靶點；根據gRNA靶點合成插入片段，并構建敲除質粒；將敲除質粒轉染至Hela細胞，得到GCK基因突變的Hela細胞模型；其中，所述gRNA靶點的序列如SEQ ID No.1所示。經活性檢測及測序鑒定得到的GCK基因突變的Hela細胞模型，為一穩定可靠的模型，可用于由GCK基因突變所致的單基因糖尿病的診斷和精確分型，進而實現個體化治療，給予患者最優化治療方案的基礎，對于疾病進程、預后的判斷及對家族遺傳指導具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及生物技術技術領域，尤其是涉及一種GCK基因突變的Hela細胞模型及其構建方法和應用。

背景技術

糖尿病是一種受遺傳和環境等因素影響的慢性代謝性疾病，糖尿病及其并發癥給我國的經濟發展和人民健康帶來沉重負擔。

在糖尿病患者中，約1-4％的患者為單基因糖尿病，這類患者的糖尿病是由單個基因異常改變而引起胰島β細胞功能失常所致，且單基因糖尿病的發生幾乎不受環境的影響。單基因糖尿病主要包括新生兒糖尿病(NDM)和青少年發病的成人型糖尿病(MODY)。其中，青少年發病的成人型糖尿病是一組常染色體顯性遺傳病，MODY家系中攜帶突變基因的健康成員的患病風險高達95％，且同一家系的患者臨床表現高度相似。

在歐洲，MODY占總糖尿病人群的1％-2％。內分泌學界認為，至少有6種不同基因中的一種突變導致了MODY，包括編碼葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)的基因(MODY2)和編碼5個轉錄因子的基因：肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor，HNF-4A(MODY1)、HNF-1A(MODY3)、胰島素啟動因子1(insulin promoter factor，IPF-1)(MODY4)、HNF-1B(MODY5)以及神經元性分化因子1(neuronal differentiation 1，NEUROD1)(MODY6)。

其中，患病率占第二位的MODY是由葡糖激酶基因(GCk)突變所致的MODY2，葡糖激酶不僅是糖代謝過程中關鍵的限速酶，在β細胞中它還可以通過感受血糖水平調節胰島素的分泌，因此被稱為“葡萄糖感受器”。MODY2患者多表現為無癥狀的、非進展性的、輕度空腹血糖升高，糖耐量實驗2小時血糖水平僅輕度升高，該類患者并發癥風險低，胰島分泌功能異常不明顯。

因此，對由GCK基因突變所致的單基因糖尿病的診斷和精確分型是實現個體化治療，給予患者最優化治療方案的基礎，并且對于疾病進程、預后的判斷及對家族遺傳指導具有重要的意義。

本發明致力于提供一種可用于單基因糖尿病的診斷和精確分型的GCK基因突變的Hela細胞模型以及其構建方法和應用。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種GCK基因突變的Hela細胞模型的構建方法，該構建方法操作簡單便捷，所得細胞模型穩定可靠；

本發明的第二目的在于提供一種GCK基因突變的Hela細胞模型，可用于由GCK基因突變所致的單基因糖尿病的診斷和精確分型。

本發明提供一種GCK基因突變的Hela細胞模型的構建方法，包括以下步驟：

S1、針對GCK基因需要突變的目的基因位點，設計gRNA靶點；

S2、根據gRNA靶點合成插入片段，并構建敲除質粒；

S3、將敲除質粒轉染至Hela細胞，得到GCK基因突變的Hela細胞模型；

其中，所述gRNA靶點的序列如SEQ ID No.1所示。