[發明專利]內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa及其應用

在審

• 申請號: 202210992874.4
• 申請日: 2022-08-18
• 公開（公告）號: CN115927259A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 成艷芬;孟振祥;呂東海;朱偉云
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;A23K20/189;C12R1/19
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明公開了內切葡聚糖酶突變體TrepCel4?Aa及其應用。所述內切葡聚糖酶突變體TrepCel4?Aa的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示，其是由氨基酸序列為SEQ?ID?No.1的內切葡聚糖酶的第201位的組氨酸突變為色氨酸以及第252位的谷氨酸突變為酪氨酸獲得的，且編碼該突變體的基因的核苷酸序列如SEQ?IDNo.5所示。所述內切葡聚糖酶突變體TrepCel4?Aa只包含一個糖苷水解酶家族5的模塊區，并在大腸桿菌中成功表達，純化后的酶液活性好，對天然木質纖維素具有很好的水解能力，不僅豐富了內切葡聚糖酶的菌種來源，在提高飼料纖維的消化率、改善動物生產性能方面具有理論上的指導意義。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa及其應用。

背景技術

木質纖維素生物質是地球上用于工業生物精煉的最豐富、便宜和循環利用的原材料。木質纖維素生物質可通過工業生物精煉轉化為紙質用品、紡織品及生物乙醇等。目前有超過200種化學品和多聚合物是通過生物精煉從木質纖維素生物質中提取。此外，農作物秸稈是重要的木質纖維素源之一，主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的協同作用可以高效水解纖維素。內切葡聚糖酶具有更高的水解纖維素的能力，因為它可以隨機地從內部斷開纖維素主鏈的β-1,4-糖苷鍵。內切葡聚糖酶現已廣泛應用于工業生物精煉及動物飼料添加劑。

隨著宏基因組篩選方法的廣泛運用，目前已有多種內切葡聚糖酶從草食動物的瘤胃中獲得，如駝鹿、綿羊、水牛、奶牛和駱駝。但是大部分候選纖維素酶沒有被克隆和表征。具有高水解能力的纖維素酶對于生物煉制工業來說是必不可少的，以此減少纖維素酶的使用量，從而提高經濟效益。內切葡聚糖酶通過底物結合口袋與底物錨定，進一步被活性催化位點催化。因此底物結合口袋的穩定決定了水解酶最終的催化效率。因此，挖掘瘤胃微生物宏基因組中內切葡聚糖酶可以為內切葡聚糖酶的開發提供新的研究思路，同時對底物結合口袋進行適當的定點突變，提高酶與底物結合穩定性，用作飼料酶制劑，可以提高飼料轉化率，增加生產效益。

發明內容

本發明提供了內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa及其應用，本發明從水牛瘤胃微生物基因組中得到一種內切葡聚糖酶，并進行突變獲得內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa，然后進行表達、純化，獲得的酶液有助于在分離纖維素以及提升其在飼料、酶制劑等領域中的應用。

為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明提供了內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示。

進一步的，所述內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa是由氨基酸序列為SEQ?ID?No.1的內切葡聚糖酶的第201位的組氨酸突變為色氨酸以及第252位的谷氨酸突變為酪氨酸獲得的。

進一步的，所述內切葡聚糖酶突變體只包含糖苷水解酶第5家族；其能夠從內部水解纖維素的主鏈，且最適溫度和最適pH分別為50℃和6.0。

本發明還提供了一種編碼基因，其為編碼所述的內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa的基因，核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示。

本發明還提供了包含所述的編碼基因的重組表達載體。

本發明還提供了包含所述的編碼基因的重組菌株，所述菌株為大腸桿菌。

本發明還提供了所述的內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa在制備用于降解纖維素的酶制劑中的應用。

進一步的，所述纖維素為天然木質纖維素；所述天然木質纖維素為稻秸、麥秸、羊草或甜菜渣。

進一步的，所述酶制劑中，內切葡聚糖酶突變體TrepCel4-Aa的濃度為0.2mg/mL～0.8mg/mL。