[發(fā)明專利]活性聚集肽及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210984387.3
• 申請日: 2022-08-17
• 公開（公告）號: CN116102628A
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李爽;馬佳媛;朱晁誼;劉佩伶
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C07K14/245
• 分類號: C07K14/245;C07K19/00;C12P21/00
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 張珍

1.一種活性聚集肽，其特征在于：其氨基酸序列為如下任一序列所示：

HlyA218：GNSLAKNVLSGGKGNDKLYGSEGADLLDGGEGNDLLKGGYGNDIYRYLSGYGHHIIDDDGGKDDKLSLADIDFRDVAFRREGNDLIMYKAEGNVLSIGHKNGITFRNWFEKESGDISNHQIEQIFDKDGRVITPDSLKKALEYQQSNNKASYVYGNDALAYGSQDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLSGNASDFSYGRNSITLTASA；

HlyA60：LAYGSQDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLSGNASDFSYGRNSITLTASA；

H12：QDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLS；

H1：QDNLNPLINEISKIISAA；

H2：ERAAASLLQLS。

2.權(quán)利要求1中所述的活性聚集肽在高效介導(dǎo)形成重組蛋白活性包涵體中的應(yīng)用。

3.一種重組蛋白活性包涵體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)將重組表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，獲得重組細(xì)胞；所述重組表達(dá)構(gòu)建體包括編碼融合蛋白的多核苷酸序列與表達(dá)控制序列；所述融合蛋白包括目的蛋白、構(gòu)建在目的蛋白羧基端的權(quán)利要求1中所述的活性聚集肽以及目的蛋白與活性聚集肽之間的連接肽；

(2)培養(yǎng)步驟(1)所得重組細(xì)胞，表達(dá)所述融合蛋白，獲得包含融合蛋白的活性包涵體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的表達(dá)控制序列為啟動子、增強(qiáng)子、核糖體作用位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄剪接序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和穩(wěn)定mRNA的序列中的任意一種或多種組合；

步驟(2)的具體操作為：將步驟(1)所得重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收獲的細(xì)胞經(jīng)裂解后去除上清，收集不可溶部分，獲得包含融合蛋白的活性包涵體。

5.一種重組蛋白活性包涵體，其特征在于：通過權(quán)利要求3或4的制備方法得到。

6.一種重組蛋白包涵體的純化方法，其特征在于：包括如下步驟：利用兩步洗滌法對權(quán)利要求5中所述的重組蛋白活性包涵體進(jìn)行純化，獲得純化后的融合蛋白；所述兩步洗滌法包括如下步驟：

第一步：使用含TritonX-100的磷酸鈉緩沖液重懸活性包涵體，置冰上孵育20±2min；

第二步：離心去除上清后使用磷酸鈉緩沖液洗滌活性包涵體；

所述TritonX-100在體系中的體積濃度為0.8±0.1％；

所述磷酸鈉緩沖液的濃度為50±5mM，pH為7.0±0.2；

所述離心的條件為轉(zhuǎn)速12000±1000rpm、溫度4±2℃、時(shí)間5±2min。

7.一種重組蛋白，其特征在于：由目的蛋白、構(gòu)建在目的蛋白羧基端的權(quán)利要求1中所述的活性聚集肽以及目的蛋白與活性聚集肽之間的連接肽組成。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組蛋白，其特征在于：所述目的蛋白為酶蛋白，所述重組蛋白為重組酶蛋白。

9.權(quán)利要求8中所述的重組酶蛋白作為原位固定化酶在生物催化反應(yīng)中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：

所述重組酶蛋白重復(fù)回收利用至少30次。