[發(fā)明專利]一種油杉體細胞胚發(fā)生體系的建立方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210983857.4
• 申請日: 2022-08-17
• 公開（公告）號: CN115299343B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發(fā)明（設計）人: 韓學敏;曾慶銀;王丹;金宇霆
• 申請（專利權(quán)）人: 中國林業(yè)科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N5/04
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 黃明光

本發(fā)明提供了一種油杉體細胞胚發(fā)生體系的建立方法及其應用，屬于林業(yè)中細胞工程種苗繁殖領(lǐng)域。本發(fā)明所述油杉體細胞胚發(fā)生體系的建立方法包括：以未成熟合子胚為外植體進行誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、調(diào)整培養(yǎng)和成熟培養(yǎng)，分化形成體細胞胚。本發(fā)明所述方法成功建立了油杉體細胞胚胎發(fā)生體系，突破了油杉營養(yǎng)繁殖困難，生長周期長，發(fā)芽率低等瓶頸，成為林木快速繁殖、優(yōu)異性狀保持和品種改良的一條新興途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于林業(yè)中細胞工程種苗繁殖領(lǐng)域，尤其涉及一種油杉體細胞胚發(fā)生體系的建立方法及其應用。

背景技術(shù)

云南油杉(Keteleeria?evelyniana)屬松科油杉屬，是東南亞特有的松科孑遺植物，喜暖耐干旱，具有強陽性、抗旱、耐瘠薄等特點，樹皮栓皮層厚，耐火性強，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值。云南油杉天然分布于云南西北部至中部，貴州西部至西南部，四川西南部至西部，海拔分布范圍1100～2300m。近幾十年，由于人為的開墾、開發(fā)，導致其生境破碎化，為了第三紀孑遺屬植物資源的保護利用和瀕危種保育，有必要建立規(guī)模化的高效繁育體系。在自然界，云南油杉主要通過種子進行繁殖，種子發(fā)芽和成苗受到眾多因素的影響，包括種子質(zhì)量及環(huán)境生態(tài)因子等，繁殖效率低。目前，現(xiàn)有技術(shù)中云南油杉也主要通過種子進行有性繁殖，然而云南油杉種子含油脂、不耐貯藏，只能隨采隨播，且云南油杉的種子發(fā)芽率低，一顆種子只能發(fā)育形成一顆樹，這些都不利于常規(guī)的種子繁殖對云南油杉進行擴繁，因此，有必要開發(fā)建立云南油杉的無性繁殖方式。

體細胞胚胎發(fā)生是指體細胞在人工控制的條件下，未經(jīng)性細胞融合而經(jīng)過一系列與合子胚發(fā)生類似的途徑發(fā)育形成新個體的形態(tài)發(fā)生過程。植物體細胞胚胎發(fā)生是針葉樹種通過生物技術(shù)手段進行規(guī)?；療o性繁殖的重要途徑。在林木的大量繁殖、種質(zhì)保存和遺傳轉(zhuǎn)化等諸多領(lǐng)域中具有巨大的應用價值。但不同屬之間體細胞胚發(fā)生的條件差異非常大，甚至是同一個屬不同種之間體細胞胚發(fā)生的條件也差異非常大，因而關(guān)于云南油杉的體細胞胚發(fā)生體系的建立方法并未有報道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種油杉體細胞胚發(fā)生體系的建立方法，突破了油杉營養(yǎng)繁殖困難，生長周期長，發(fā)芽率低等瓶頸，成功建立了油杉體細胞胚胎發(fā)生體系。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種油杉體細胞胚發(fā)生體系的建立方法，所述方法包括：以未成熟合子胚為外植體進行誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、調(diào)整培養(yǎng)和成熟培養(yǎng)，分化形成體細胞胚。

優(yōu)選的，所述合子胚處于原胚團時期、胚胎形成早期及胚胎形成晚期。

優(yōu)選的，所述誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、調(diào)整培養(yǎng)、成熟培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基為改良1/2MS培養(yǎng)基；

所述改良1/2MS培養(yǎng)基中KI?4.1～4.2mg/L、H₃BO₃?15.4～15.6mg/L、VitaminB₁0.9～1.1mg/L、Vitamin?B₆0.9～1.1mg/L。

優(yōu)選的，誘導培養(yǎng)基為：改良1/2MS培養(yǎng)基+2,4-D?0.2～1mg/L+6-BA?0.1～2mg/L+KT?0～0.5mg/L+TDZ?0～0.01mg/L+肌醇80～120mg/L+水解酪蛋白450～550mg/L+谷氨酰胺400～500mg/L+蔗糖25～35mg/L+瓊脂6～8g/L；pH為5.8～6.2。

優(yōu)選的，增殖培養(yǎng)基為：改良1/2MS培養(yǎng)基+2,4-D0.05～0.15mg/L+6-BA0.02～0.09mg/L+肌醇450～550mg/L+水解酪蛋白450～550mg/L+谷氨酰胺400～500mg/L+蔗糖25～35mg/L+瓊脂6～8g/L；pH為5.8～6.2。