[發明專利]一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法

在審

• 申請號: 202210977048.2
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115197966A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 付任貞;陳彥平;黃偉東
• 申請（專利權）人: 深圳源興基因技術有限公司
• 主分類號: C12N15/863
• 分類號: C12N15/863;C12N7/00;C12N7/02;C12N5/071;C12N5/09
• 代理公司: 北京市浩東律師事務所 11499
• 代理人: 孫莉

1.一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、細胞的復蘇與傳代；

S2、生物反應器的準備工作；

S3、細胞的收集與培養；

S4、痘病毒的感染；

S5、痘病毒的維持培養及收獲。

2.根據權利要求1所述的一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法，其特征在于，所述細胞的復蘇與傳代是將293貼壁細胞加入細胞培養液后放入到CO₂培養箱中培養，細胞長成單層后，消化細胞，并制成均勻的細胞懸液，分種于培養瓶中，加入細胞培養液繼續培養，細胞這樣傳代2-3次后，消化收集培養瓶中的細胞，并接種于10層細胞工廠，然后加入細胞培養液繼續培養。

3.根據權利要求1所述的一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法，其特征在于，所述細胞的復蘇與傳代是將Hela-F細胞加入細胞培養液放入到搖床上培養，細胞長到1～3×10⁶個/ml，分種于培養瓶中，加入細胞培養液繼續培養，擴增至1L或2L搖瓶中，或者擴增至20L細胞袋中。

4.根據權利要求2所述的一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法，其特征在于，所述生物反應器的準備工作是將300g～500g片狀載體裝入固定床生物反應器14L罐體里，加入10～12LPBS，然后將罐體連同其中的載體及PBS一并經高壓蒸汽滅菌，高壓蒸汽滅菌的溫度為121℃，時長為60～120分鐘；

滅菌后冷卻至常溫，將PBS排出罐體，加入細胞培養液(10％血清DMEM)，攪拌轉速100rpm，pH7.2±0.05，溶氧(DO)20％～50％，培養溫度37℃。

5.根據權利要求4所述的一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法，其特征在于，所述細胞的收集與培養是將10層細胞工廠細胞消化收集至接種瓶中，從瓶中取樣計數細胞，然后將細胞接種于固定床生物反應器，初始密度為2～5×10⁵個/ml，細胞培養初始設定攪拌轉速為40～70rpm，隨著細胞生長和DO控制，逐漸加大攪拌轉速至80～120rpm，細胞培養液是10％血清DMEM培養液，培養過程中可通過監測葡萄糖濃度，計算葡萄糖的消耗情況來反映、監測細胞的分裂生長情況；當葡萄糖濃度下降至0.5～3g/L，開始灌注；根據葡萄糖濃度調節灌注量，灌注量在0.5VVd-2.5VVd。

6.根據權利要求5所述的一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法，其特征在于，所述痘病毒的感染是直接將罐內液體換為病毒感染液(2％血清培養液)，將重組痘苗病毒接入細胞罐中，MOI為0.02～0.2，感染6小時，攪拌轉速40～60rpm，pH7.2±0.05自動調節，溶氧(DO)20％～50％自動調節，培養溫度35℃，6小時后開啟灌注灌注量2.5～4VVD。

7.根據權利要求6所述的一種利用生物反應器大規模生產重組痘苗病毒載體的方法，其特征在于，所述痘病毒的維持培養及收獲的步驟為：染毒24h，罐內液體和灌流培養液更換為無血清DMEM培養液，繼續灌流培養至染毒48～96小時，排空罐內液體，加入裂解液(20mMTris/0.8mMMgCl₂pH8.0)4～5次裂解，收獲裂解液。