[發明專利]一種高產四氫嘧啶的重組谷氨酸棒桿菌及其應用

在審

• 申請號: 202210973252.7
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115786219A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 徐美娟;饒志明;江安;張顯;楊套偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/31;C12P17/12;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

1.一種重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，在宿主基因組上的二氫吡啶二羧酸合成酶基因dapA啟動子下游插入阻遏蛋白BetI結合序列，并在檸檬酸合酶基因gltA啟動子下游插入阻遏蛋白LmrA結合序列；同時過表達了施氏假單胞菌來源的四氫嘧啶合成基因簇ectBAC、偶聯了阻遏蛋白LmrA的5’UTR序列的阻遏蛋白基因lmrA、谷氨酸棒桿菌來源的反饋抑制解除的天冬氨酸激酶基因lysC^S301Y，大腸桿菌來源的天冬氨酸半醛脫氫酶基因asd以及偶聯了阻遏蛋白BetI的5’UTR序列的阻遏蛋白基因betI；

所述阻遏蛋白BetI結合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述阻遏蛋白LmrA結合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

阻遏蛋白BetI的5’UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～14任一所示，所述阻遏蛋白基因lmrA的5’UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～21任一所示。

2.如權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述四氫嘧啶合成基因簇ectBAC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述阻遏蛋白基因lmrA的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述阻遏蛋白基因betI的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述天冬氨酸激酶基因lysC^S301Y基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述天冬氨酸半醛脫氫酶基因asd的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.如權利要求2所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述重組谷氨酸棒桿菌采用pXMJ19質粒或pEC-XK99E質粒為表達載體。

4.如權利要求3所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述重組谷氨酸棒桿菌采用pXMJ19質粒表達四氫嘧啶合成基因簇ectBAC、偶聯了阻遏蛋白LmrA的5’UTR序列的阻遏蛋白基因lmrA；同時采用pEC-XK99E質粒表達了谷氨酸棒桿菌來源的反饋抑制解除的天冬氨酸激酶基因lysC^S301Y，大腸桿菌來源的天冬氨酸半醛脫氫酶基因asd以及偶聯了阻遏蛋白BetI的5’UTR序列的阻遏蛋白基因betI。

5.如權利要求4所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述阻遏蛋白BetI的5’UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述阻遏蛋白基因lmrA的5’UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

6.一種生產四氫嘧啶的方法，其特征在于，所述方法為采用權利要求1～5任一所述的重組谷氨酸棒桿菌發酵制備四氫嘧啶。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法為，將重組谷氨酸棒桿菌接種至種子培養基中，得到種子液；將制備得到的種子液按照18～20％的接種量接種至發酵培養基中，發酵制備得到四氫嘧啶。

8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，將重組谷氨酸棒桿菌接種至種子培養基中進行培養，培養條件為：28～32℃，控制種子培養基初始pH為7.0～7.2。

9.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，將重組谷氨酸棒桿菌接種至種子培養基中進行培養，得到一級種子液；將一級種子液按照10％的接種量轉接至種子培養基中，進行培養，得到二級種子液；將制備得到的二級種子液按照20％的接種量接種至發酵培養基中進行發酵，制備得到四氫嘧啶。

10.權利要求1～5任一所述的重組谷氨酸棒桿菌，或權利要求6～9任一所述的方法在制備含有四氫嘧啶的產品中的應用。