[發明專利]尿液中DNA的提取方法、試劑盒及基因標志物在制備診斷膀胱癌的試劑盒中的應用

在審

• 申請號: 202210973032.4
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115976011A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 李南南;楊琴;吳逵;林從;李甫強;羅甜;羅慧娟;趙鑫
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12Q1/6851;C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 路秀麗

1.一種尿液中DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：

a)將尿液離心后獲得尿沉渣，

b)利用TE緩沖液洗滌所述尿沉渣，

c)提取所述尿沉渣中DNA。

2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述c)包括：在利用所述TE緩沖液洗滌所述尿沉渣后，

向所述尿沉渣中加入溶菌酶，孵育，以破壞細菌細胞壁；或

向所述尿沉渣中加入玻璃砂，震蕩，以破壞所述細菌細胞壁；

優選地，所述TE緩沖液與所述尿液的體積比為1:10～30，更優選為1:20；

優選地，對洗滌后的所述尿沉渣進行重懸，得到重懸液，將所述溶菌酶與所述重懸液按體積比1～2:3的比例混合，優選為體積比7:11，混合后置于35～37℃下處理30min～120min，優選45～60min。

3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，破壞所述細菌細胞壁后，使用DNA提取試劑盒，提取所述尿液中DNA；

優選地，所述DNA提取試劑盒包括吸附柱、蛋白酶K、GB緩沖液、乙醇、GD緩沖液、PW漂洗液；

優選地，所述尿液中DNA包括尿液微生物DNA和宿主DNA。

4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法還包括：設置空白對照的步驟；

優選地，按如下方法設置所述空白對照：

向空白對照管中加入含有核酸助沉劑或糖原的無菌水；

更優選地，所述無菌水中所述核酸助沉劑或糖原的體積含量為0.5～1.5％。

5.一種檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括檢測尿沉渣中DNA含量的試劑。

6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測尿沉渣中DNA含量的試劑為檢測尿沉渣中微生物DNA含量的試劑；

優選地，所述檢測尿沉渣中微生物DNA含量的試劑為檢測尿沉渣中微生物DNA含量的特異性序列拷貝數的試劑；

更優選地，所述特異性序列選自SEQ?ID?NO：1。

7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，檢測所述拷貝數的檢測試劑包括構建測序文庫的相關試劑或PCR擴增檢測相關試劑；

優選地，所述構建測序文庫的相關試劑包括構建二代測序文庫的相關試劑，更優選為構建宏基因組測序文庫的相關試劑；

優選地，所述PCR擴增檢測相關試劑包括實時熒光定量PCR的相關試劑；

優選地，所述試劑包括SEQ?ID?NO：2和/或SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。

8.一種檢測尿液DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

利用權利要求1至4中任一項所述的提取方法提取所述尿液DNA，

對所述尿液DNA中的靶標基因進行檢測；

優選地，采用權利要求5至7中任一項所述的檢測試劑盒進行檢測；

更優選地，采用SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列對SEQ?ID?NO：1所述的靶標基因進行實時熒光定量PCR檢測。

9.基因標志物在制備診斷膀胱癌的試劑盒中的應用，其中，所述基因標志物為具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的基因。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述應用包括對尿液DNA中的所述基因標志物進行定性和/或定量檢測；

優選地，利用權利要求1至4中任一項所述的提取方法提取所述尿液DNA；

優選地，采用構建測序文庫或實時熒光定量PCR的方法，對所述基因標志物進行定性和/或定量檢測；

更優選地，采用SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列，對所述基因標志物進行定性和/或定量檢測。