[發明專利]一種銀鯧肝臟細胞系及其應用

有效

• 申請號: 202210969223.3
• 申請日: 2022-08-12
• 公開（公告）號: CN115094028B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 蔣歡;王亞軍;張友儀;王冠林;王想兵
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02;C12Q1/70;C12R1/91;C12R1/93
• 代理公司: 北京識然知識產權代理事務所(普通合伙) 11975
• 代理人: 曾慶國

本發明提供一種銀鯧肝臟細胞系及其應用，所提供的細胞系的保藏編號為CCTCC?NO:C202261。本發明的銀鯧肝臟細胞系細胞性狀優良，可連續傳代，通過傳代能夠提供大量的銀鯧肝臟細胞系；本發明的銀鯧肝臟細胞系的構建方法重復性強、構建的細胞系穩定性好。本發明的銀鯧肝臟細胞系易感染虹彩病毒、高效表達外源基因，同時適用于脂多糖和棕櫚酸對肝臟細胞產生影響的體外研究。

技術領域

本發明屬于海水魚類細胞培養技術領域，具體涉及一種銀鯧肝臟細胞系及其應用。

背景技術

魚類的細胞系被廣泛認為是研究水產養殖包括魚類生長、疾病、繁殖、遺傳學和生物技術等許多關鍵問題的重要工具。自1962年建立第一個魚類細胞系RTG-2以來，已經從不同類型的魚類組織樣本包括鰓、鰭、眼、肝和腎等建立了約880多個魚類細胞株。基于肝臟在硬骨魚類中的關鍵作用，首次分離肝臟細胞用于金魚細胞中激素刺激的糖原分解研究；來自黃鰭鯛(Acanthopagrus?latus)肝臟的ALL細胞系用于研究對三種主要魚類病毒敏感時先天免疫基因的表達；石斑魚(Epinephelus?awoara)的肝臟GL細胞系用于石斑魚虹彩病毒的繁殖，并研究了從該細胞系分離的病毒特性。此外，對巨石斑魚(Epinephelus?tauvina)肝臟細胞系GL-av進行了基因修飾，以評估抗凋亡蛋白Bcl-xL的有效性；來源于虹鱒肝臟的RTH-149細胞系用于解讀與魚類營養相關的分子機制。簡言之，大量研究表明肝臟細胞系是研究魚類營養和代謝以及免疫調節基因的重要工具。

銀鯧(Pampus?argenteus)是一種高價值的海洋經濟魚類，廣泛分布在東南亞和中東的沿海海域。由于銀鯧適合在海洋網箱和室內水池中養殖，銀鯧的人工繁育和養殖技術已經標準化。然而，由細菌性、病毒性或寄生蟲等病原引起的病害日益頻繁爆發，已成為了制約銀鯧產業化的主要因素之一。因此，迫切需要具有穩定性狀的體外細胞系工具來研究銀鯧養殖過程中病原體逃逸宿主免疫反應的機制。

發明內容

本發明的目的是提供一種銀鯧肝臟細胞系及其應用，所提供的細胞系能夠用于研究銀鯧養殖過程中病原體逃逸宿主免疫反應的機制。

本發明首先提供一種增殖快且穩定的銀鯧肝臟細胞系PaL，于2022年3月18日保藏于中國典型培養物保藏中心(武漢大學)，地址為湖北省武漢市武昌區八一路299號，郵編：430072，保藏編號為CCTCC?NO:C202261。

本發明所提供的銀鯧肝臟細胞系PaL的構建方法如下：

1)原代培養：無菌條件下獲取銀鯧幼魚肝臟組織，置于添加雙抗(青霉素和鏈霉素)的基礎培養基中，用含1％雙抗的無菌D-hanks漂洗和清理肝臟組織上的附著物，移入含細胞培養液的離心管中用剪刀剪成小塊，離心后取上清，加入胰蛋白酶室溫消化30分鐘后加入等體積的完全培養基終止消化，而后全部轉移到100目細胞篩過濾，濾液離心棄上清，加入完全培養基重懸細胞，最后將懸液轉至培養瓶中于22±0.2℃培養箱正置培養；

2)傳代培養：待原代培養組織塊周圍細胞遷出并增殖至形成單層細胞時，加入0.25％胰蛋白酶消化液使細胞懸起，而后利用完全培養基進行傳代培養，待原瓶傳代細胞長滿瓶底后，以1：1或1：2分瓶傳代，之后3-4天傳代一次。傳至10代之后，傳代所用0.25％胰蛋白酶替換為重組酶。

本發明所提供的銀鯧肝臟細胞系PaL在研究銀鯧養殖過程中病原體逃逸宿主免疫反應的機制中的用途；

所述的病原，作為實施例的一種具體記載，為虹彩病毒；

本發明所提供的銀鯧肝臟細胞系PaL還用于研究脂多糖和棕櫚酸對肝臟細胞的影響。

本發明的有益效果如下：

1、本發明的銀鯧肝臟細胞系細胞性狀優良，可連續傳代，通過傳代能夠提供大量的銀鯧肝臟細胞系；

2、本發明的銀鯧肝臟細胞系的構建方法重復性強、構建的細胞系穩定性好；