[發明專利]rcAAV5檢測用探針和引物組合及其用途

在審

• 申請號: 202210969102.9
• 申請日: 2022-08-12
• 公開（公告）號: CN116121447A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 張琪夢;楊志行;宗偉英;盧雙紅
• 申請（專利權）人: 湖州申科生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京律智知識產權代理有限公司 11438
• 代理人: 李華

本發明提供了檢測rcAAV5的引物和探針組合以及其用途。通過本發明的引物和探針組合進行檢測時，可以快速、靈敏、準確且低成本地檢測rAAV5中rcAAV5的污染率。

技術領域

本申請涉及病毒檢測領域，更具體涉及重組腺相關病毒中復制型重組腺相關病毒的檢測。

背景技術

腺相關病毒(adeno-associated?virus,AAV)屬細小病毒科無包膜的線狀DNA病毒，只有在輔助病毒(通常是腺病毒)存在下才能實現病毒復制。AAV能感染多種類型的人體細胞因此又被分為多種血清型。典型的AAV2基因組約4800bp，由兩個反向末端重復序列(inverted?terminal?repeat或ITR，145bp)和兩個開放閱讀框(ORF)rep和cap基因組成。ITR對于病毒的復制和包裝起決定性作用，是合成互補DNA鏈所必需的。cap基因編碼病毒衣殼蛋白，rep基因參與病毒的復制和整合。據報道，靈長類動物體內有13種不同血清型的AAV(即AAV1-AAV13)，其中AAV2、AAV3、AAV9源自人類本身，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最為徹底、應用最為廣泛的病毒。相對于AAV2，AAV5在進化上與其距離甚遠，且兩者間的同源序列較少，研究也較少，但AAV5的應用范圍很廣，能感染眼睛、中樞神經系統、胰臟、肺等人體重要的器官組織。

重組腺相關病毒(Recombination?adeno-associated?virus,rAAV)是在非致病的野生型AAV基礎上改造而成的基因載體，rAAV包裝的基因組刪除了全部AAV蛋白編碼序列，并且添加治療性基因表達盒，唯一的病毒來源序列是ITR，它們是在載體生產過程中指導基因組復制和包裝所必需的。由于rAAV病毒載體具有種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細胞范圍廣(對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力)、擴散能力強、體內表達基因時間長等優勢，所以又被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一。

然而，在生產rAAV載體過程中，轉染用的質粒或宿主細胞DNA與rAAV之間會由于物理接近而產生大量的rAAV載體基因組、rep和cap基因以及ITR序列發生非同源重組，從而形成具有復制能力的AAV(Replication?competent?AAV,rcAAV)。

雖然rcAAV顆粒與任何已知的人類疾病無關，但作為污染物rcAAV顆粒可能會影響rAAV基因表達，并且在許多AAV基因轉移研究中是一個不受控制的變量。近期的動物實驗表明，cap基因在體內的表達會引發嚴重的免疫反應，而包裝有其他DNA雜質的rcAAV則具有致瘤性或引入抗生素抗性的潛在風險。采用傳統工藝生產的rAAV中，rcAAV污染率可高達10％，即使采用優化工藝，rcAAV污染率也可達到0.4％-1％，因此，rAAV中rcAAV污染率的測定非常必要。

由于rAAV制品中rcAAV的危害不小，但污染量相對較低，因此必須設計出高靈敏度的方法才能對其進行檢測和定量分析。現有的檢測方法有兩種：一種是利用細胞培養法結合qPCR的方法，另一種是qPCR快檢法。前一種方法目前最常用，但也存在不可避免的弊端：首先，它的敏感性依賴于rcAAV對靶細胞的感染效率，相較于AAV2型來說許多其他AAV血清型(1、3、5、6、7)在培養過程中不能有效地感染靶細胞(例如HECK293/293T細胞)，導致檢測靈敏度降低，檢測值會低于實際值；其次，該方法耗時較長，投入成本較高。qPCR快檢法(直接檢測法)恰恰可以彌補細胞培養法的不足，它可以在短時間內實現對rcAAV的檢出，但因檢測片段太短不能保證檢物具備rcAAV復制所需的完整序列，故導致檢出的rcAAV不一定具有復制能力，檢測值一般會高于實際值。

然而本領域仍然需要能夠快速、靈敏且準確地檢測rAAV5中rcAAV5污染率的低成本方法。

發明內容