[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雷公藤遺傳轉(zhuǎn)化方法及甲素獲取方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202210955250.5 | 申請日： | 2022-08-10 |
| 公開（公告）號： | CN115354047B | 公開（公告）日： | 2023-05-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 祝傳書;張斌;吳華;王勇;馬志卿 | 申請（專利權(quán)）人： | 西北農(nóng)林科技大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/84 | 分類號： | C12N15/84;A01H5/00;A01H6/00;A01H4/00 |
| 代理公司： | 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216 | 代理人： | 孫雅靜 |
| 地址： | 712100 陜*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 桿菌 雷公藤 遺傳 轉(zhuǎn)化 方法 獲取 | ||
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雷公藤遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）以雷公藤葉為外植體，置于農(nóng)桿菌侵染液中進(jìn)行侵染，得到侵染后的外植體；
（2）侵染后的外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)外植體；共培養(yǎng)外植體于篩選培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，篩選抗性愈傷組織；
（3）抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生；不定芽于生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，光照下培養(yǎng)得到抗性幼苗；取抗性幼苗的葉片，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定和篩選，獲得陽性幼苗；陽性幼苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中，得到轉(zhuǎn)基因植株；
所述的農(nóng)桿菌侵染液含有10mM?的MgCl2、10mM?的2-嗎啉乙烷磺酸和100μM的乙酰基丁香酮；所述的農(nóng)桿菌侵染液中農(nóng)桿菌OD600為0.4～1.0；
所述的置于農(nóng)桿菌侵染液中進(jìn)行侵染，包括：外植體浸泡于農(nóng)桿菌侵染液中5～20min，后進(jìn)行真空侵染，真空侵染壓力為-0.05～-0.09Mpa，侵染時間3～5min；
所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有0.2～1.0?mg/L的2，4-D、0.1～0.5?mg/L?的KT和0～100μM乙酰基丁香酮的MS固體培養(yǎng)基；所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為1～5d；
所述的篩選培養(yǎng)基為含有0.2～1.0?mg/L?2,4-D、0.1~0.5?mg/L?KT、100～400?mg/L特美汀和100?mg/L?卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基；或?qū)⒖敲顾靥鎿Q為25?mg/L的潮霉素B；
所述的分化培養(yǎng)基為含0.5～2.0?mg/L?6-芐基氨基嘌呤和?0.05～0.5mg/L萘乙酸的MS固體培養(yǎng)基；
所述的生根培養(yǎng)基為含0.5～4?mg/L?IBA或NAA的MS固體培養(yǎng)基；還對（1）中的雷公藤葉進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)的條件為黑暗；
所述的雷公藤葉預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有0.2～1.0?mg/L?2,4-D?和?0.1～0.5?mg/L?KT的MS固體培養(yǎng)基；所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為2～5d。
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