[發明專利]一種產磷脂酶D的SBT5工程菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202210949410.5
• 申請日: 2022-08-09
• 公開（公告）號: CN116004491A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 芮雙印;朱鵬翔
• 申請（專利權）人: 安徽大千生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/55;C12N15/76;C12Q1/44;C12Q1/60;C12R1/465
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 王偉

1.一種產磷脂酶D的SBT5工程菌，其特征在于，所述工程菌包括如SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。

2.一種產磷脂酶D的SBT5工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)磷脂酶D基因的定點突變

選擇S.chromofuscus色褐鏈霉菌來源的磷脂酶D作為野生型磷脂酶D的目的基因，基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；

對所述目的基因進行定點突變，將目的基因中的連續兩個丙氨酸Ala利用人工誘導突變為兩個甘氨酸Gly，以獲得適合在變鉛青鏈霉菌SBT5中高效表達的基因序列，突變后的基因序列如SEQ?ID?NO.2所示；

(2)突變體的篩選

剔除掉突變不完全、誘變不徹底的基因，選擇突變完全、序列清晰的目的基因進行下一步操作；

(3)磷脂酶D基因突變體的糖基化位點分析

將定點突變后的磷脂酶D基因利用相關軟件分析蛋白的糖基化位點；

(4)糖基化位點定點優化及全基因合成

為了消除潛在的被糖基化修飾位點影響，將潛在的糖基化位點的脯氨酸Pro優化為精氨酸Arg，并將糖基化位點改造后的序列進行全基因合成；最終改造后的基因序列如SEQ?IDNO.3所示；

(5)初步工程菌的獲得

將步驟(4)完成的序列連接在pMS82載體上，且基因上下游分別插入NotI和EcoRI酶切位點，接著轉化入SBT5菌獲得初步工程菌；

(6)pMS82-PLDAnti質粒的抽提

對步驟(5)得到的初步工程菌進行質粒提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質粒的質量，檢測合格的pMS82-PLDAnti質粒繼續用于后續實驗；

(7)重組鏈霉菌菌株的構建

將檢測合格的pMS82-PLDAnti質粒轉入變鉛青鏈霉菌SBT5，即得目標所需的產磷脂酶D的SBT5工程菌。

3.根據權利要求2所述的產磷脂酶D的SBT5工程菌的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中，采用定量PCR或熒光免疫原位雜交檢測目的基因的突變情況，剔除掉突變不完全、誘變不徹底的基因，選擇突變完全、序列清晰的目的基因進行下一步操作。

4.根據權利要求2所述的產磷脂酶D的SBT5工程菌的構建方法，其特征在于，所述步驟(3)中，利用NetNGlyc?1.0Server在線軟件分析蛋白的糖基化位點。

5.一種如權利要求1所述的產磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL-C檢測試劑盒開發中的應用，其特征在于，利用所述產磷脂酶D的SBT5工程菌所產生的磷脂酶D作為催化劑生產sdLDL-C檢測試劑盒。