[發(fā)明專利]一種PEG介導(dǎo)的腐皮鐮刀菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210948173.0
• 申請(qǐng)日: 2022-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN116004699A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梅鵬穎;朱致豫;李隆云;劉群棟;宋旭紅;崔廣林;丁剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶市中藥研究院
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N15/65;C12R1/77
• 代理公司: 重慶航圖知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發(fā)明公開了一種PEG介導(dǎo)的腐皮鐮刀菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，通過腐皮鐮刀菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選，將含有篩選標(biāo)記的外源DNA片段轉(zhuǎn)化入腐皮鐮刀菌基因組中。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了PEG介導(dǎo)的腐皮鐮刀菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，建立了一套完整的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選方法，獲得大量高強(qiáng)度表達(dá)潮霉素抗性蛋白和綠色熒光蛋白且穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化菌株，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)9000個(gè)轉(zhuǎn)化子/mg?DNA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種PEG介導(dǎo)的腐皮鐮刀菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的方法。

背景技術(shù)

黃連是我國常用大宗藥材，全球五成黃連來自“黃連之鄉(xiāng)”-重慶石柱縣。在石柱，黃連是高山地區(qū)的主導(dǎo)和扶貧產(chǎn)業(yè)，超過80％的農(nóng)民以種植黃連為生，黃連種植收入約占農(nóng)業(yè)收入的70％。近年來，黃連根腐病已嚴(yán)重制約石柱黃連產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，平均發(fā)病率達(dá)40％，嚴(yán)重地塊達(dá)80％-90％，且藥劑防治效果有限，導(dǎo)致連農(nóng)種植意愿下降，種植面積減少，給石柱黃連產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，了解黃連根腐病發(fā)生機(jī)理成為解決該問題的關(guān)鍵。黃連根腐病是由腐皮鐮刀菌(Fusarium?solani)引起的一種重要的土傳真菌病害。由于黃連根腐病研究起步較晚，研究基礎(chǔ)薄弱，缺乏合適的遺傳轉(zhuǎn)化體系成為進(jìn)一步深入研究的重要限制因素。因此，建立一種簡單、高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)于研究黃連根腐病的致病機(jī)理具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種PEG介導(dǎo)的腐皮鐮刀菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、一種PEG介導(dǎo)的腐皮鐮刀菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包含如下步驟：

1)收集腐皮鐮刀菌的新鮮菌絲，然后加入含有細(xì)胞壁裂解酶的原生質(zhì)體緩沖液酶解至菌絲裂解及原生質(zhì)體釋放；所述細(xì)胞壁裂解酶為kitalase酶；

2)將酶解后的原生質(zhì)體過濾，然后用穩(wěn)滲劑溶液沖洗，離心收集沉淀，再用穩(wěn)滲劑溶液重新懸浮，離心收集沉淀；

3)加入STC溶液重懸，離心收集沉淀，再次用STC溶液重懸；

4)將步驟3)重懸的原生質(zhì)體調(diào)節(jié)濃度為2～5×10⁷個(gè)原生質(zhì)體/mL，然后將待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒加入原生質(zhì)體中，通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，篩選，獲得原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化子。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟1)中，所述細(xì)胞壁裂解酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5～1％。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟1)中，所述收集的腐皮鐮刀菌新鮮菌絲的方法如下：將菌齡7d的腐皮鐮刀菌菌絲接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、160rpm搖培20～24h，過濾收集菌絲。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟1)中，所述酶解時(shí)間為2.5～3h。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟2)中，所述穩(wěn)滲劑為0.7M?NaCl溶液。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟2)中，所述過濾為用無菌雙層Miracloth過濾；步驟2)或步驟3)中，所述離心為4℃、3000rpm離心8min。

本發(fā)明優(yōu)選的，所述PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的具體方法如下：在原生質(zhì)體懸浮液中加入待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，混勻后冰上放置25min；再逐滴加入5倍體積的PTC緩沖液，滾動(dòng)混勻25min；最后加入8倍體積的含羧芐青霉素的TB3培養(yǎng)基，28℃、160rpm復(fù)蘇4-5h。

本發(fā)明優(yōu)選的，所述待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒加入量按每100μL原生質(zhì)體懸浮液加入2.5～3μg待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。

本發(fā)明優(yōu)選的，所述STC緩沖液的組分為：蔗糖200g/L，0.5M?Tris-HCl?100mL/L，CaCl₂·2H₂O?7.35g/L，溶劑為水；