[發(fā)明專利]三維培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備皮膚損傷修復(fù)與再生的藥物或制劑中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210947872.3
• 申請(qǐng)日: 2022-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN115154484A
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉廣;吳瓊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中晶生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K35/28
• 分類號(hào): A61K35/28;A61P37/06;A61P37/02;A61P17/02;C12N5/0775
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1.三維培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備皮膚損傷修復(fù)與再生的藥物或制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述外泌體提取自羊的胎盤組織、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為經(jīng)過體外三維培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述皮膚損傷修復(fù)與再生為對(duì)皮膚的割傷、紫外線損傷、有毒有害氣/液體損傷、擦傷、燒傷、皮膚創(chuàng)面感染和慢性難愈合創(chuàng)面損傷的修復(fù)與再生；三維培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用、抑制皮膚炎癥，促進(jìn)皮膚愈合，降低瘢痕產(chǎn)生。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過如下方法制備獲得：

1)間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離：將羊的胎盤、子宮內(nèi)膜等組織經(jīng)預(yù)處理后，取其間充質(zhì)區(qū)，分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外二維條件下的擴(kuò)增培養(yǎng)；

2)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增到第二代時(shí)，將間充質(zhì)干細(xì)胞種植于低粘附板上進(jìn)行三維培養(yǎng)擴(kuò)增，間充質(zhì)干細(xì)胞將在三維條件下進(jìn)行成球培養(yǎng)。

3.間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的提?。簩?quán)利要求2步驟2）中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)分離提取得到外泌體。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟1）所述預(yù)處理是指將羊胎盤羊膜面、底蛻膜面、臍帶根部、臍帶部等分別剝離、子宮內(nèi)膜組織等分別進(jìn)行處理，將組織經(jīng)無菌的生理鹽水清洗后，再用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基清洗，然后離心棄上清，得到胎盤不同部位的間充質(zhì)區(qū)。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟1）所述間充質(zhì)干細(xì)胞通過如下方法獲得：將預(yù)處理后的不同胎盤部位的間充質(zhì)區(qū)切塊，置于不含有雙抗的無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入混合膠原酶消化，得到間充質(zhì)干細(xì)胞后使用篩網(wǎng)進(jìn)行過濾。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2）所述培養(yǎng)是指將間充質(zhì)干細(xì)胞置于低粘附板上，無血清培養(yǎng)基中，37℃和5% CO₂條件培養(yǎng)24h-48 h。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求3所述分離提取是指將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液離心，收取上清液后進(jìn)行離心處理，獲得的上清液過濾后再次離心，棄上清，向沉淀中加入生理鹽水混勻得到懸液，將懸液離心后棄上清，加入無菌生理鹽水溶液后靜置，然后過濾，獲得間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述混合膠原酶用量為細(xì)胞體積的1-5倍，所述膠原酶的濃度為0.075-0.1g/mL。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求3所述收取上清液后進(jìn)行離心處理中，離心處理是指將細(xì)胞上清液經(jīng)1 ,500×g離心10min，收取上清；再經(jīng)10，000×g離心30min；所述懸液離心條件為120,000×g離心60min。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述過濾均為經(jīng)過0 .22μm濾器進(jìn)行過濾；所述靜置時(shí)間為30min。