[發明專利]一種強化乳鐵蛋白表達的畢赤酵母及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202210946281.4
• 申請日: 2022-08-08
• 公開（公告）號: CN115960175A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;吳文揚;李江華;劉延峰;周國霖;崔世修
• 申請（專利權）人: 江南大學;內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K14/79;C12R1/84
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林

本發明公開了一種強化乳鐵蛋白表達的畢赤酵母及其構方法與應用。本發明首先篩選了常用的信號肽，然后將不同的信號肽進行整合，構建雜合型信號肽，使乳鐵蛋白能夠在細胞器中快速傳遞，促進乳鐵蛋白的分泌。本發明通過不同信號肽之間的組合，能夠有效的提高乳鐵蛋白的表達量，并通過westernblot發現乳鐵蛋白的表達量增加了約5倍，高達98mg/L。

技術領域

本發明屬于代謝工程技術領域，尤其是指一種強化乳鐵蛋白表達的畢赤酵母及其構方法與應用。

背景技術

乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)又稱乳轉鐵蛋白，是一種分子量約為80kDa的鐵結合蛋白，也是乳汁中重要的球蛋白。研究表明，LF不僅存在于乳汁中，也廣泛分布于淚液、唾液、膽汁等多種分泌液中。其中乳汁中的含量最高，LF在人乳中的含量居第二位，濃度高達1.0-3.0mg/mL，是牛乳中的10倍。LF不僅可以轉運鐵離子，同時還具有抗菌、消炎及調節機體免疫反應等生物學活性。

除了抑菌活性外LF還具備明顯的殺菌活性。一方面，LF表面的堿性高密度電荷易與細菌的某些生物分子進行分特異性結合，擾亂細胞膜的功能；另一方面，LF可以特異性的結合到細菌細胞膜上，導致膜通透性增加，甚至破壞脂質雙分子層，從而起到殺菌作用。進一步研究發現，LF的殺菌活性區主要位于N葉，不同于鐵離子結合區的區域，LF的N端依賴自身的正電荷與細菌細胞膜上帶有負電荷的脂多糖、磷壁酸等產生靜電吸引，從而使整個LF結合至細菌的細胞膜上，最終損害細胞膜。因此，LF被認為是一種新型抗菌、抗癌的藥物。目前，LF已被添加到許多商業產品中，包括嬰兒配方粉、熱療飲料、發酵乳、化妝品和牙膏等。LF的多種促進健康的功能及其在現實生活中的廣泛應用激發了越來越多的研究興趣。

目前，獲得乳鐵蛋白的方式主要是從牛初乳中通過分離純化獲得。然而，在提取的過程中存在分離步驟繁瑣，純化難度高等問題，重要的是異源蛋白可能引起人體的過敏反應。為了獲得大量乳鐵蛋白，研究者利用基因工程技術構建多種底盤細胞(大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞植物細胞)用于生產乳鐵蛋白。

底盤細胞中本身的啟動子、信號肽、終止子為蛋白的表達提供了基礎，這些表達元件決定了蛋白的表達水平，然而這些元件并不一定是最適合蛋白的元件。為了挖掘更多的表達元件，研究者使用綠色熒光蛋白作為指示劑，通過轉錄組、蛋白質組、以及生物信息分析等技術探索細胞內潛在的表達元件，并根據熒光強度的變化確定新的表達元件。

在過去的十幾年中，研究者以微生物細胞作為宿主進行了人乳鐵蛋白的異源表達。微生物表達系統雖然具有生長快，操作簡單的特點，還具各翻譯后加工和修飾功能，但其系統固有的一些缺陷比如人源性蛋白分子、細胞因子不能在酵母中高效表達，并且蛋白產物容易形成多聚體進而導致蛋白降解，積聚的原因主要是合成的蛋白不能正常分泌到胞外，對細胞分泌系統造成很大的壓力，易引起細胞的崩潰，導致外源蛋白的降解，減少蛋白的產量。此時需要挖掘新的表達元件使蛋白能夠快速的分泌到胞外。研究者主要通過優化表達系統中的信號肽的種類，增強外源蛋白的表達水平，所用的表達元件往往來源于細胞自身，這限制了異源蛋白的分泌。

發明內容

為了解決乳鐵蛋白在畢赤酵母中積聚，導致分泌效率低的問題，本發明提供了一種強化乳鐵蛋白表達的畢赤酵母及其構建方法與應用。同時為了引導乳鐵蛋白在畢赤酵母中快速再各個細胞器中穿梭，并快速的分泌到細胞外，實現增強乳鐵蛋白的高效表達。該方法首先篩選了常用的信號肽，然后將不同的信號肽進行整合，構建雜合型信號肽，使乳鐵蛋白能夠在細胞器中快速傳遞，促進乳鐵蛋白的分泌。具體以piCZa、piC9k質粒出發，首先用不同信號肽將a-factor因子信號肽進行替換，并驗證不同信號肽對乳鐵蛋白表達量的影響。進一步將上述效果明顯的信號肽與a-factor進行整合，構建雜合型信號肽，最后通過將不同信號肽進行組合優化，證明OST-a-factor整合信號肽、SUC-a-factor整合信號肽、INU-a-factor整合信號肽為最佳組合，獲得三株乳鐵蛋白高效合成的畢赤酵母菌株。本發明不僅實現提高乳鐵蛋白表達量的目的，同時也提供了一種增加蛋白表達元件的方法。