[發明專利]高產5-氨基乙酰丙酸的工程菌株及5-氨基乙酰丙酸高產菌株的構建方法

在審

• 申請號: 202210940821.8
• 申請日: 2022-08-07
• 公開（公告）號: CN115747125A
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 孫際賓;陳久洲;蒲偉;鄭平;周文娟;石拓;蔡檸勻
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/77;C12P13/00;C12R1/19;C12R1/15
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

1.一種構建5-ALA高產工程菌株的方法，其特征在于，增強菌株中5-氨基乙酰丙酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、5-ALA轉運蛋白以及5-ALA氧化損傷修復系統相關蛋白的活性，并且弱化或敲除琥珀酰輔酶A合成酶、5-氨基乙酰丙酸脫水酶以及異檸檬酸裂解酶的活性。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強5-氨基乙酰丙酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、泛酸激酶、5-ALA轉運蛋白、5-ALA氧化損傷修復系統相關蛋白的活性是通過增加編碼蛋白的多核苷酸的拷貝數、對編碼蛋白的基因的調控序列進行修飾、用具有強活性的序列置換染色體上編碼蛋白的基因的調控序列、用突變基因置換編碼蛋白的基因、在染色體上編碼蛋白質的基因中引入修飾以增強蛋白質的活性。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱化琥珀酰輔酶A合成酶、5-氨基乙酰丙酸脫水酶、異檸檬酸裂解酶的活性是通過部分或全部敲除酶的編碼基因、基因突變失活或部分失活、基因啟動子或翻譯調控區改變令其轉錄或翻譯弱化、改變基因序列使其mRNA穩定性減弱或酶結構不穩定、通過sRNA對基因進行弱化調控、通過外源性添加酶活性的抑制劑以弱化其活性。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述5-ALA轉運蛋白是半胱氨酸/O-乙酰絲氨酸轉運蛋白，所述5-ALA氧化損傷修復系統相關蛋白是谷氧還蛋白I。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No：49所示，或所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No：49所示序列的75位由半胱氨酸突變為丙氨酸，第365位的精氨酸突變為賴氨酸。

6.如權利要求1至5任一項所述的方法，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌。

7.一種高產5-ALA的重組工程菌株，其特征在于，由如權利要求1至6任一項所述的方法制備得到。

8.一種生產5-ALA的方法，其特征在于，發酵培養如權利要求7所述的5-ALA重組工程菌株以產生5-ALA。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，還包括從培養基中分離5-ALA的步驟。

10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述發酵培養的發酵培養基為KH₂PO₄ 5g/L，NH₄Cl 8 g/L，酵母粉 5 g/L，MgSO₄ 0.5 g/L，0.01 g/L泛酸鈣，消泡劑0.1 g/L和葡萄糖20 g/L。