[發明專利]基于納米孔測序同時獲取病毒整合轉錄本和RNA修飾的檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202210932147.9
• 申請日: 2022-08-04
• 公開（公告）號: CN115198035A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 倪守峰;王偉偉;劉星宇;張利利;田埂
• 申請（專利權）人: 北京元碼醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6869;G16B30/10;G16B20/30;C12R1/93
• 代理公司: 北京北匯律師事務所 11711
• 代理人: 李英杰

本發明公開一種基于納米孔測序同時獲取病毒整合轉錄本和RNA修飾的檢測方法及應用。包括：獲得生物樣品的總RNA；使總RNA經過分離純化得到mRNA；將mRNA與逆轉錄接頭連接；使逆轉錄接頭與納米孔測序接頭連接；通過鏈特異性測序，使帶有病毒整合的mRNA的文庫單鏈通過位于芯片的納米孔，而不測序互補cDNA鏈，同時檢測出病毒整合轉錄本和RNA上的修飾信息。本發明的方法具有長片段測序的優勢，同時能夠獲取堿基修飾信息，實現了簡單、準確的單分子水平檢測。此外，本發明的方法能夠避免反轉錄和PCR中的偏好性，以及逆轉錄和擴增過程中對RNA修飾信息的丟失，保留RNA天然屬性，獲得多種堿基變異，結構變異與修飾信息，從而能夠區分高度相似的異構體、識別新轉錄本。

技術領域

本發明涉及核酸檢測技術領域，具體地涉及一種基于納米孔測序同時獲取病毒整合轉錄本和RNA修飾的檢測方法和應用。

背景技術

宮頸癌是婦科中最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著婦女的健康。人類乳頭瘤病毒(HPV)的DNA整合入宿主基因組，被認為是宮頸癌發生發展中的關鍵事件。HPV的整合水平與生殖道上皮惡性腫瘤和癌前病變密切相關。從感染HPV到發展成為宮頸癌約需數年或更長時間，通過檢查HPV感染與否和HPV基因組整合狀態，指導臨床治療，對于宮頸癌防治具有重要意義。

目前已有HPV檢測方法存在一定的缺陷，具體如下：

1.細胞學檢查(巴氏涂片、薄層液基細胞)，該方法不夠敏感，假陰性高，不易推廣，不能明確HPV基因組整合狀態。

2.分子檢測(DNA)：有雜交捕獲檢測(HC-Ⅱ)、實時熒光定量PCR技術(Cobas4800)、基因芯片法等，缺陷在于不能測定具體的HPV型別或特異性差，不能明確HPV基因組整合狀態等。

3.基于二代NGS測序的基因組插入片段的檢測，因為讀長短，整合斷點位于重復序列可能導致基因融合分析的難度大、漏檢和誤判等。DNA水平的檢測無法判斷病毒插入的基因是否仍具有轉錄活性，也無法獲取病毒插入基因的表達與修飾的信息。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，發明人進行了深入研究，提出一種基于納米孔測序同時獲取病毒整合轉錄本和RNA修飾的檢測方法。具體地，本發明包括以下內容。

本發明的第一方面，提供一種基于納米孔測序同時獲取病毒整合轉錄本和RNA修飾的檢測方法，其包括以下步驟：

(1)獲得來源于生物樣品的總RNA；

(2)使所述總RNA經過分離純化得到mRNA；

(3)將所述mRNA與逆轉錄接頭連接；

(4)使步驟(3)中的逆轉錄接頭與納米孔測序接頭連接；和

(5)使所述mRNA或其部分通過位于芯片的納米孔，其中，所述芯片設置于電極附近，且所述電極能夠檢測通過所述納米孔的電流。

在某些實施方案中，根據本發明所述的方法，其中，在連接逆轉錄接頭后進行逆轉錄和逆轉錄產物純化，其中，使用逆轉錄試劑合成第一鏈cDNA。

在某些實施方案中，根據本發明所述的方法，其中，進一步包括：通過分析，以確定病毒整合狀態和RNA修飾信息，其中所述病毒為人類乳頭瘤病毒。

在某些實施方案中，根據本發明所述的方法，其中，所述逆轉錄接頭序列如SEQ IDNo.:1-2所示。在某些實施方案中，所述逆轉錄接頭為適用于ONT平臺逆轉錄RTA接頭。優選地，所述逆轉錄接頭序列包括：

Oligo A：5'-/5PHOS/GGCTTCTCTTTGCTTAGGTAGTAGGTTC(SEQ ID No.1)；