[發(fā)明專利]一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210931858.4
• 申請日: 2022-08-04
• 公開（公告）號: CN115851622A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 駱能松;林坤章;韓增鵬;徐富強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/864;A61K49/00
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 姚幸茹;范盈

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法和應(yīng)用。所述重組腺相關(guān)病毒的制備方法包括以下步驟：S1：重組腺相關(guān)病毒血清型包裝質(zhì)粒的構(gòu)建。S2：重組腺相關(guān)病毒的制備。本發(fā)明主要構(gòu)建了重組腺相關(guān)病毒rAAV?F的包裝質(zhì)粒，并基于三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒，能夠高效快速獲得高滴度的重組腺相關(guān)病毒rAAV?F，所獲得的rAAV?F可以高效逆行標(biāo)記神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，為神經(jīng)環(huán)路示蹤提供新的的工具載體，為疾病模型建立和基因治療等提供了更好的工具和技術(shù)支撐，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和光明的市場前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

逆行標(biāo)記工具病毒載體在神經(jīng)科學(xué)研究和基因治療網(wǎng)絡(luò)給藥等方面具有十分重要的作用。已經(jīng)報(bào)道的逆行標(biāo)記病毒載體包括慢病毒(LV)、單純皰疹病毒(HSV)、偽狂犬病毒(PRV)、狂犬病毒(RABV)和腺相關(guān)病毒(AAV)等，上述病毒載體可以對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有效標(biāo)記，但諸如慢病毒(LV)、單純皰疹病毒(HSV)、偽狂犬病毒(PRV)和狂犬病毒(RABV)對神經(jīng)細(xì)胞毒性大，滿足不了神經(jīng)科學(xué)功能網(wǎng)絡(luò)研究和基因治療的需求。重組腺相關(guān)病毒(rAAV)具有毒性低、高效轉(zhuǎn)基因遞送、長期穩(wěn)定表達(dá)和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已成為神經(jīng)科學(xué)研究和基因治療最受歡迎的病毒載體之一。目前使用最廣泛的重組腺相關(guān)病毒rAAV2-retro相較于其他腺相關(guān)病毒具有較高的逆行標(biāo)記效率(Neuron,2016,92(2):372-382.)，但存在腦區(qū)選擇性(Neurosci BμLl,2020,36(3):202-216.)，主要感染皮層神經(jīng)元，標(biāo)記范圍有限。

因此，本發(fā)明提供一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中病毒載體毒性大、標(biāo)記范圍小的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中病毒載體毒性大、標(biāo)記范圍小的問題，本發(fā)明提供一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法。

該重組腺相關(guān)病毒的制備方法包括以下步驟：

S1：重組腺相關(guān)病毒血清型包裝質(zhì)粒的構(gòu)建：以質(zhì)粒pAAV2/9為模板，序列如SEQID NO.1所示的基因片段為正向引物，序列號如SEQ ID NO.2所示的基因片段為反向引物，采用PCR擴(kuò)增，獲得pAAV2/F質(zhì)粒，所述pAAV2/F質(zhì)粒的序列如SEQ ID NO：3所示；

S2：重組腺相關(guān)病毒的制備：將裝載核心元件的質(zhì)粒、腺病毒元件輔助質(zhì)粒和所述pAAV2/F質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，包裝后獲得所述重組腺相關(guān)病毒。

進(jìn)一步地，S1中PCR擴(kuò)增體系體積為50μL，包括2×FastPfuFly PCRSuperMix25μL，10μM所述正向引物1μL，10μM所述反向引物1μL，所述質(zhì)粒pAAV2/9 2μL，ddH₂O 31μL。

進(jìn)一步地，PCR擴(kuò)增方法為：98℃5min，98℃30s，60℃30s，72℃5min，72℃10min，16℃30min，36個循環(huán)。

進(jìn)一步地，S1中擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)去甲基化酶處理轉(zhuǎn)化感受態(tài)Stbl3大腸桿菌，包括以下步驟：

所述擴(kuò)增產(chǎn)物需添加1μL模板消化酶DMT，37℃消化1小時；消化后的所述擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Stbl3，菌落PCR鑒定為陽性的單菌落活化并接種到15mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序。

進(jìn)一步地，S2中所述裝載核心元件的質(zhì)粒為pAAV-hSyn-H2B-mCherry-WPRE-hGHpolyA、所述腺病毒元件輔助質(zhì)粒為pAd-Helper。