[發明專利]前列腺癌的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒及其專用引物和探針

在審

• 申請號: 202210931213.0
• 申請日: 2022-08-04
• 公開（公告）號: CN115851926A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 居金良;崔振玲;張適麒;冉鵬展
• 申請（專利權）人: 上海仁度生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發明公開一種前列腺癌的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒及其專用引物和探針，屬于腫瘤診斷技術領域。提供的試劑盒包括基于實時熒光核酸恒溫擴增方法的分別特異性檢測以下基因的試劑：PCA3、ERG、DLX1、HOXC6、HOXC4、TDRD1、AMACR和MALAT1，以及任選的SPDEF和/或KLK3，該試劑盒能夠以患者隨機尿液作為待測樣本高靈敏度檢出前列腺癌(包括血PSA灰區)，并具有極高的陰性預測值，因此能夠有效避免陰性對象進行不必要的前列腺穿刺活檢。

技術領域

本發明屬于腫瘤診斷技術領域，具體涉及一種適用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測體系的前列腺癌檢測試劑盒及其專用引物和探針。

背景技術

前列腺癌(prostate cancer，PCa)的發病率在泌尿系統腫瘤發病率中排名首位。目前前列腺癌臨床診斷方式主要包括：直腸指檢、直腸前列腺B超及多參數核磁共振等影像學檢查，和血PSA(Prostate Specific Antigen)檢測。直腸檢測對前列腺癌的診斷敏感性和特異性均較低，且受人為素影響大；以多參數核磁共振為代表的影像學檢查僅對臨床有意義型前列腺癌具有較好的診斷效果，但對一些早期前列腺癌的診斷仍有一定局限性；通過前列腺穿刺活檢檢測血PSA是目前診斷前列腺癌的金標準，但在血PSA灰區(4-10ng/mL)人群患者中僅有25％左右的陽性檢出率，造成了約75％的患者經歷不必要的穿刺活檢。另外，前列腺穿刺活檢還會對患者造成較大痛苦，亦有發生感染等風險。因此，急需一種無創的且適用于血PSA灰區人群患者的前列腺癌檢測方法。

專利文獻CN111518908A(以下稱文獻1)公開一種尿液前列腺癌標志物組合及其在制備精準診斷試劑中的用途，該文獻1以TMPRSS2-ERG(T2ERG)、PCA3、SChLAP1、MALAT1、TTTY15-USP9Y、HOXC6和DLX1為檢測前列腺癌的標志物組合，可以以尿液為檢測樣本，且能夠高特異性(78.0％)和高靈敏度(87.8％，表示可以將87.8％的陽性患者篩查出來)地對前列腺癌患者(包括血PSA灰區患者)進行檢測和篩查(AUC最大為0.87(95％CI：0.78-0.93))。然而，一方面，該文獻1公開的是適用于PCR反應體系的檢測前列腺癌標志物的組合，PCR反應過程中需要溫度的升降和循環，因此所需檢測時間較長，效率較低，同時需要使用熒光定量PCR儀，增加了檢測成本；另外，PCR的反應產物為DNA，不易降解，容易導致樣本交叉污染和實驗環境的污染；另一方面，雖然該文獻1能夠實現高準確度檢測前列腺癌的目的，但其檢測的靈敏度仍偏低，且陰性預測值也偏低(81.3％，表示在實際陰性對象中僅判定有81.3％的檢測對象為真陰性)，因此仍有較多的陽性患者篩查不到，以及有較多的陰性對象需要經歷不必要的穿刺活檢。

發明內容

針對現有技術中存在的一個或多個問題，本發明一個方面提供一種前列腺癌的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，其包括基于實時熒光核酸恒溫擴增方法的分別特異性檢測以下基因的試劑：PCA3、ERG、DLX1、HOXC6、HOXC4、TDRD1、AMACR和MALAT1；任選地，所述試劑盒還包括基于實時熒光核酸恒溫擴增方法的特異性檢測SPDEF基因和/或KLK3基因的試劑，所述SPDEF基因和/或KLK3基因作為檢測內參基因。

在一些實施方式中，針對每一種基因的特異性檢測試劑包括與該種基因對應的：

(1)核酸提取液：其包含含有特異性捕獲探針的固相支持物和第一引物，其中所述捕獲探針用于捕獲基因序列，所述第一引物用于與基因序列中的靶標序列特異性結合；

(2)檢測液a：其包含第二引物，所述第二引物與所述第一引物配合，用于擴增靶標序列；

(3)檢測液b：其包含第一引物和靶標檢測探針，其中所述靶標檢測探針與靶標的擴增產物RNA拷貝特異性結合；

任選的，試劑盒中還包括：

(4)SAT酶液：其包含至少一種RNA聚合酶和M-MLV反轉錄酶。

在一些實施方式中，