[發明專利]重組質粒、小RNA隨機過表達質粒文庫及其建立方法和應用

在審

• 申請號: 202210930894.9
• 申請日: 2022-08-04
• 公開（公告）號: CN115948452A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 李盛本;陳月
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業基因組研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/46;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 劉桐亞

本發明提供了一種重組質粒、小RNA隨機過表達質粒文庫及其建立方法和應用，涉及生物技術領域。本發明提供的重組質粒，包括第一表達單元和第二表達單元，其中，第二表達單元從5’至3’依次包括第二啟動子和miRNA173編碼序列；第一表達單元從5’至3’依次包括第一啟動子和TAS1c基因，TAS1c基因中產生成熟tasiRNA的序列替換為ccdB基因，ccdB基因5’端和3’端分別設置酶切位點。采用酶切方法將該重組質粒中的ccdB基因替換為小RNA表達序列，產生的小RNA與內源反式作用小RNA類似、長度為21nt、具有5’尿嘧啶的小RNA，并可以高效對靶基因進行表達調控。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種重組質粒、小RNA隨機過表達質粒文庫及其建立方法和應用。

背景技術

RNA具有豐富的多樣性，在整個生命進程中發揮著各種各樣的功能。根據RNA編碼蛋白質的功能有無，可分為信使RNA(messenger?RNA，mRNA)和非編碼RNA(non-coding?RNA,ncRNA)，小RNA是一類非常重要的ncRNA。小RNA無開放閱讀框，但在調節細胞生長和分化的過程中扮演著非常重要的角色，主要通過轉錄后調控改變靶基因的表達來影響生物體的生長發育和生理代謝，有重要的基因表達調控功能，代表了新的基因表達調控的方式。小RNA參與植物的幾乎所有生長發育過程，如種子萌發、根系和葉片發育、花器官的形態建成、生殖、激素信號傳導、細胞代謝、誘導器官分化和性別決定等，同時在植物抗病時發揮作用，還能介導植物對干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫的抗性，是植物正常生長發育所必需的。

水稻和玉米作為世界上最主要的糧食作物，世界上一半以上的人口以水稻和玉米為食，油菜是重要的油料作物，還可當作飼料來使用，這些農作物與我們的正常生活息息相關。然而，目前受各種環境因素的影響，水稻，玉米，油菜每年都遭受大量的損失，而這些農作物本身的內源小RNA在抗病，抵御外界不良環境，提高產量等方面起著重要的作用，越來越多的植物內源小RNA在抗病，抵抗不良環境，提高產量上得到了廣泛的應用。

目前小RNA的研究方法主要有四種，過表達的兩種：小RNA前體序列的組成型表達和Artificial?microRNA，下調表達的兩種：short?tandem?target?mimic(STTM)和targetmimicry。這四種方法一次只能對一種小RNA進行表達干預。植物基因組中存在著豐富的不同種類的小RNA，玉米、小麥和大豆等農作物轉基因效率低、周期長，利用以上方法對小RNA功能進行逐一研究需要耗費大量的時間和成本，不利于小RNA生物學功能的系統研究和廣泛應用。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種重組質粒。

本發明的第二目的在于提供一種小RNA隨機過表達質粒文庫的建立方法，以解決上述問題中的至少一種。

本發明的第三目的在于提供一種小RNA隨機過表達質粒文庫。

本發明的第四目的在于提供一種上述重組質粒或者上述小RNA隨機過表達質粒文庫在植物內源小RNA功能高通量研究中的應用。

本發明的第五目的在于提供一種植物內源小RNA功能高通量研究的方法。

本發明的第六目的在于提供一種miR319a-3p在調控植物分蘗中的應用。

本發明的第七目的在于提供一種小RNA，該小RNA具有調控植物育性或結實率的作用。

本發明的第八目的在于提供一種小RNA在調控植物育性或結實率中的應用。

第一方面，本發明提供了一種重組質粒，包括第一表達單元和第二表達單元；