[發(fā)明專利]一種快速檢測大豆基因耐鹽性的方法

在審

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• 申請日: 2022-08-03
• 公開（公告）號: CN115141843A
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 齊玉軍;王幸;邢興華;徐澤俊;童飛;王好讓;李思夢
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（江蘇徐州甘薯研究中心）
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54;G01N21/25;G06T7/11;G06T7/90
• 代理公司: 西安合創(chuàng)非凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61248
• 代理人: 高志永

本發(fā)明涉及耐鹽性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測大豆基因耐鹽性的方法，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，抑制目的基因表達(dá)，然后通過發(fā)根農(nóng)桿菌接種于大豆下胚軸，待發(fā)根長至5～10 cm時(shí)，鹽脅迫處理15～18 h，獲取倒一展開復(fù)葉的圖像；提取圖像CMYK模式下C值，根據(jù)C值將耐鹽性分為5級，由低到高分別為Ⅰ級（C值40）、Ⅱ級（40≥C值35）、Ⅲ級（35≥C值25）、Ⅳ級（25≥C值15）和Ⅴ級（15≥C值5.0）。本發(fā)明利用發(fā)根接種大豆下胚軸能夠快速得到根部陽性的轉(zhuǎn)基因大豆植株的特點(diǎn)，利用數(shù)字化技術(shù)定量描述葉片顏色動(dòng)態(tài)，能夠準(zhǔn)確快速的實(shí)現(xiàn)大豆基因耐鹽性的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及耐鹽性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測大豆基因耐鹽性的方法。

背景技術(shù)

在驗(yàn)證大豆基因耐鹽性時(shí)，經(jīng)常會利用轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生理指標(biāo)的檢測來進(jìn)行功能驗(yàn)證，無論是轉(zhuǎn)基因植株的獲得還是生理指標(biāo)的檢測，工作強(qiáng)度和周期都較長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植株所產(chǎn)生的發(fā)根具有生長速度快，分化程度高，生理生化和遺傳性穩(wěn)定、易于操作等特點(diǎn)，利用發(fā)根接種大豆下胚軸能夠快速得到根部陽性的轉(zhuǎn)基因大豆植株，而葉片顏色變化是反映植物內(nèi)在生理功能和生長狀態(tài)的重要特征，利用數(shù)字化技術(shù)定量描述葉片顏色動(dòng)態(tài)，能夠準(zhǔn)確快速反應(yīng)植物的生理變化，基于此，本發(fā)明提供了一種快速檢測大豆基因耐鹽性的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種快速檢測大豆基因耐鹽性的方法，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，抑制目的基因表達(dá)，然后通過發(fā)根農(nóng)桿菌接種于大豆下胚軸，待發(fā)根長至5～10 cm時(shí)，鹽脅迫處理15～18 h，獲取倒一展開復(fù)葉的圖像；提取圖像CMYK模式下C值，根據(jù)C值將耐鹽性分為5級，由低到高分別為Ⅰ級（C值40）、Ⅱ級（40≥C值35）、Ⅲ級（35≥C值25）、Ⅳ級（25≥C值15）和Ⅴ級（15≥C值5.0）。具體地，在室內(nèi)用手機(jī)拍攝獲取倒一展開復(fù)葉的圖像，手機(jī)設(shè)置為自動(dòng)調(diào)焦，關(guān)閉閃光燈，采用自動(dòng)白平衡模式，圖像采集完成后，用Photoshop CC 2017打開圖像，在CMYK模式下，利用矩形工具，選取葉片中部從葉尖到葉基，用切割工具進(jìn)行切割，切割寬度為葉寬值的1/4大小，然后用標(biāo)尺計(jì)算切割的葉長，分別在葉片的1/5、2/5、1/2、3/5、4/5處用矩形工具選取葉長值的1/20作為待測區(qū)域，在每個(gè)待測區(qū)域用吸取工具隨機(jī)選5個(gè)區(qū)域進(jìn)行吸取，得出顏色的平均值，用 C值表示葉片的顏色。

上述方案中，利用發(fā)根接種大豆下胚軸能夠快速得到根部陽性的轉(zhuǎn)基因大豆植株的特點(diǎn)，利用數(shù)字化技術(shù)定量描述葉片顏色動(dòng)態(tài)，能夠準(zhǔn)確快速的實(shí)現(xiàn)大豆基因耐鹽性的檢測。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯：

圖1 鹽脅迫下不同基因發(fā)根苗倒一展開復(fù)葉葉色和C值的變化。

圖2 鹽脅迫下不同基因發(fā)根苗倒一展開復(fù)葉待測區(qū)域取樣。

圖3 鹽脅迫下不同基因發(fā)根苗倒一展開復(fù)葉葉綠素（A）和MDA（B）含量的變化。

圖4 鹽脅迫下不同基因發(fā)根苗倒一展開復(fù)葉葉綠素含量和C值相關(guān)性（A）與MDA含量和C值相關(guān)性（B）。

圖5 鹽脅迫下不同基因發(fā)根苗致死率（A）和生物量（B）的變化。

圖6 鹽脅迫下不同基因發(fā)根苗致死率和C值相關(guān)性（A）與生物量和C值相關(guān)性（B）。

圖7 鹽脅迫下不同基因發(fā)根苗產(chǎn)量的變化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。