[發明專利]一種枸杞子代的S-RNase基因型鑒定方法

在審

• 申請號: 202210922355.0
• 申請日: 2022-08-02
• 公開（公告）號: CN115927707A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 秦墾;高燕;戴國禮;黃婷;張波;周旋;段淋淵;焦恩寧;何盺孺;安巍;曹有龍;張曦燕;石志剛;趙建華;閆亞美;李彥龍;何軍;李曉鶯;王翠平
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院枸杞科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 田立媛

本發明公開了一種枸杞子代的S?RNase基因型鑒定方法，屬于農業育種及生物工程技術領域，使用如下引物通過PCR擴增進行鑒定：SB1?F、SB1?R，SB2?F、SB2?R，SB6?F、SB6?R，SC6?F、SC6?R；利用本發明方法進行枸杞子代的S?RNase基因型鑒定快速、準確，適于推廣應用。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種枸杞子代的S-RNase基因型鑒定方法。

背景技術

枸杞是茄科(Solanacease)枸杞屬(LyciumL.)的配子體GSI自交不親和植物。自交不親和性是影響枸杞產量的一個重要因素，自交不親和的枸杞品種(系)單一種植時大面積落花，嚴重影響結實及產量。自交不親和性是植物保持遺傳多樣性的一種重要機制，根據遺傳控制機理，配子體自交不親和性植物由單一的多態性S-位點控制，該位點為多基因復合體，至少包括花柱S基因與花粉S基因，已經明確薔薇科、茄科及玄參科等GSI類植物具有共同的花柱S核酸酶(S-RNase)。S-RNase是雌蕊與花粉相互識別的關鍵物質，可通過信號識別控制花粉能否伸長，從而決定自交不親和或自交親和。通常S-RNase(S)基因型的鑒定主要通過雜交授粉試驗、DNA測序、固態芯片檢測、液態芯片檢測幾種方法實現，其中：

田間雜交授粉試驗的試驗方法如下：應用不同品種之間的田間“雜交授粉試驗”，用雜交后座果率來判斷各品種所攜帶的S基因和品種的S基因型。即雜交后座果率來判斷各品種所攜帶的S基因和品種的S基因型，是早期研究品種間雜交親和的唯一方法。該方法具有直觀性和可操作性的優點，但是當雙親或一個親本的S基因型未知或沒有適當的測試品種時，就無法確定品種的S基因型。

克隆測序的試驗方法如下：根據保守區的序列特征設計引物，擴增出包含所有高變區的DNA序列，將測序結果利用生物信息學軟件和各種網上資源對該序列進行同源性搜索和序列比較，確定待查序列的S基因種類，該方法是當前最主要的S基因分型檢測手段。一個實驗員大約1.5周可以完成8個種質檢測，檢測1000份種質約需125*1.5＝180周，約需3.5年。

固態芯片檢測技術的試驗方法如下：根據目的基因設計相應的包含于目的擴增片段的檢測探針，采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量核酸片段有序地固化于芯片片基(如玻片、硅片等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器(如激光共聚焦掃描)對雜交信號的強度進行快速、并行、高效的檢測分析，從而獲取樣品的遺傳信息，確定樣品的基因類型。固態芯片首次開放性成本50萬元以上，發現新基因后，添加新的檢測對象信息難，后期需要專業檢測設備，單個樣品檢測成本高達100元以上。

液態芯片檢測技術的試驗方法如下：從龐大的基因組DNA中，選擇特定的靶向位點進行測序以達到基因型檢測的目的。該技術結合NCBI數據庫中的S基因序列構建枸杞屬S基因序列數據庫。依據參考枸杞品種的S基因設計探針，利用設計的探針組合物對待測枸杞樣品的DNA進行雜交捕獲、采用二代測序技術進行基因測序，并將測序結果與參考枸杞品種的S基因進行比對，通過reads數和Coverage值來區分不同的S基因，判斷待測枸杞樣品的S基因與所述參考枸杞品種的S基因是否匹配，確定待測枸杞樣品S基因所匹配的參考枸杞品種。該方法同樣存在依賴于測序、周期長、費用高的問題。

在實際的育種工作中，當雜交組合的父母本S基因型已知時，根據育種需求要對大量的雜交子代幼苗植株進行S基因型的分型鑒定以獲得每一棵雜交子代的S基因型，從而在苗期對枸杞子代做出快速、準確的篩選，以節約大量的人力、土地、農藥等管理成本，最終達到枸杞品種選育的目標。因此，需要研發一種能夠快速鑒定枸杞雜交子代S基因分型的方法，縮短鑒定時間，降低鑒定成本。

發明內容

本發明公開了一種枸杞子代的S-RNase基因型鑒定方法，用于枸杞子代的S-RNase基因型鑒定快速準確，適于推廣應用。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：