[發(fā)明專利]一種牛血紅蛋白的純化方法、牛血紅蛋白及其應(yīng)用

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• 申請日: 2022-08-01
• 公開（公告）號: CN115109147A
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王瑛;陳玉芝;尤國興;秦東;李偉丹;王權(quán);趙蓮;周虹
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;G01N33/72
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 郭凡;魯兵

1.一種牛血紅蛋白的純化方法，包括對牛紅細(xì)胞依次進(jìn)行的溶血、微濾、陰離子層析、超濾等步驟。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于，所述溶血步驟具體為：在冰浴下向紅細(xì)胞中邊通氮氣邊加入溶血劑，攪拌靜置后得到血紅蛋白液；優(yōu)選的，所述溶血劑為磷酸鹽溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述純化方法，其特征在于，所述微濾步驟具體為：將溶血步驟得到的血紅蛋白液離心，取上清液，用濾膜進(jìn)行微濾，收集微濾后的微濾液；優(yōu)選依次使用0.45μm和0.22μm的濾膜進(jìn)行微濾；更優(yōu)選的，所述濾膜為PVDF濾膜。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述純化方法，其特征在于，所述陰離子層析步驟具體為：先將微濾步驟得到的微濾液的pH調(diào)節(jié)至8.0，再用平衡緩沖液A平衡層析柱，上樣，然后用平衡緩沖液A淋洗層析柱至紫外檢測基線平穩(wěn)，加入洗脫緩沖液B進(jìn)行梯度洗脫，收集牛血紅蛋白峰的洗脫液作為層析液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述純化方法，其特征在于，梯度洗脫中線性增加洗脫緩沖液B的量由0％至100％，使得層析柱中平衡緩沖液A的量由100％至0％線性減少，層析柱中平衡緩沖液A與洗脫緩沖液B的總量為100％。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述純化方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液B為20mM Tris-HCl+(0.15-0.5)M NaCl，pH為8.0；平衡緩沖液A為20mM Tris-HCl，pH為8.0。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述純化方法，其特征在于，所述超濾步驟具體為：用截留分子量30kDa的PES超濾膜和超濾緩沖液在冰浴和氮氣氣氛下對陰離子層析得到的層析液進(jìn)行超濾，至超濾液中血紅蛋白濃度達(dá)到10g/dL停止超濾，收集的超濾液作為純化后的牛血紅蛋白產(chǎn)品；優(yōu)選所述超濾緩沖液為PBS緩沖液和P₅₀緩沖液。

8.權(quán)利要求1-7任一所述純化方法得到的牛血紅蛋白產(chǎn)品，其特征在于，其純度為99％以上(優(yōu)選99.8％以上)，P₅₀(CV)為28.69±0.11mmHg(0.40％-1.14％)、Hill系數(shù)(CV)為2.49±0.04(1.19％-1.52％)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述牛血紅蛋白產(chǎn)品，其特征在于，其在-80℃儲存5個月的過程中P₅₀的變化不超過5％。

10.權(quán)利要求1-7任一所述純化方法純化得到的或權(quán)利要求8或9所述牛血紅蛋白產(chǎn)品在制備紅細(xì)胞攜氧/釋氧功能評價裝置校驗用標(biāo)準(zhǔn)品中的應(yīng)用。