[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒多克隆抗體的制備及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2022-08-01
• 公開（公告）號(hào): CN116284431A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李越希;莊素素;李巍;沈萬鵬;李佳萌;齊永;徐應(yīng)佳;趙楠;呂瑞辰
• 申請（專利權(quán)）人: 李越希
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C07K1/14;C07K1/22;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/66;C07K16/10;C07K16/06;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 南京品智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32310
• 代理人: 奚曉寧

本發(fā)明一種新型冠狀病毒多克隆抗體的制備及其應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、多克隆抗體制備與純化技術(shù)和診斷試劑領(lǐng)域。通過大腸桿菌表達(dá)新型冠狀病毒多抗原表位嵌合蛋白，采用鎳離子螯和層析?咪唑梯度洗脫法純化出新型冠狀病毒抗原表位嵌合蛋白。將嵌合蛋白作為免疫原搭配弗氏佐劑免疫新西蘭大白兔制備兔源多克隆抗體，評價(jià)多克隆抗體效價(jià)及特異性，使用Protein?A柱純化出新型冠狀病毒多克隆抗體。分別以制備的新型冠狀病毒多克隆抗體、HRP標(biāo)記多克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體，建立雙抗夾心ELISA檢測試劑。該ELISA檢測試劑最低檢測限為0.039ng/μL，線性范圍為0.039?1.25ng/μL，檢測其他常見呼吸道病原體均為陰性結(jié)果，具有較好特異性。建立ELISA檢測試劑可用于檢測新型冠狀病毒抗原。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一種新型冠狀病毒多克隆抗體的制備及其應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、多克隆抗體制備與純化技術(shù)和診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明是將新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)包膜蛋白E的胞外區(qū)片段(長度16個(gè)氨基酸)、核衣殼蛋白N的N端片段(長度177個(gè)氨基酸)和刺突蛋白S的受體結(jié)合域RBD片段(長度223個(gè)氨基酸)用兩個(gè)連接蛋白進(jìn)行串聯(lián)，構(gòu)建出新冠病毒抗原表位嵌合蛋白序列。利用基因工程技術(shù)制備含有多個(gè)新型冠狀病毒抗原表位的嵌合蛋白，以該嵌合蛋白作為免疫原搭配弗氏佐劑免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，評價(jià)多抗的效價(jià)及特異性，采用Protein?A柱純化多克隆抗體。利用純化后的多抗制備HRP標(biāo)記多抗，分別以多抗、HRP標(biāo)記多抗為捕獲抗體及檢測抗體，建立一種雙抗夾心ELISA檢測方法，該ELISA檢測方法可用于SARS-CoV-2抗原的檢測。

背景技術(shù)

當(dāng)前正在流行的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)已經(jīng)以前所未有的方式改變了世界，給人們的生命財(cái)產(chǎn)安全帶來巨大的威脅，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大的挑戰(zhàn)。新型冠狀病毒的主要傳染源為確診患者和無癥狀感染者，主要通過呼吸道飛沫和氣溶膠在人與人之間傳播，然而，也有研究表明SARS-CoV-2可以通過受污染的物體傳播。SARS-CoV-2潛伏期為1～14天，大多為3～7天，且潛伏期內(nèi)即有傳染性。SARS-CoV-2感染后，約81％的COVID-19患者癥狀輕微；約14％的患者有呼吸困難、呼吸頻率高、體內(nèi)血氧飽和度低等嚴(yán)重癥狀；約5％的患者，特別是那些60歲以上或伴有其他疾病的患者，常常進(jìn)展為危重癥；約3.4％的患者死于呼吸衰竭或多器官功能衰竭。因此，早期、快速、準(zhǔn)確的識(shí)別SARS-CoV-2感染的患者，及時(shí)采取措施治療患者，對于防止病毒的持續(xù)傳播非常重要。

SARS-CoV-2被歸屬為β冠狀病毒屬中的一個(gè)新種，其與SARS冠狀病毒的同源性達(dá)到79.6％。SARS-CoV-2基因組為29.8～29.9kb線性非節(jié)段性單股正鏈RNA，包括14個(gè)開放性閱讀框，具有冠狀病毒的典型形態(tài)和基因組特征。SARS-CoV-2主要由4種結(jié)構(gòu)蛋白組成，它們在病毒的組裝和感染宿主中起著重要作用：刺突蛋白S負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，膜蛋白M保持病毒粒子的基本形態(tài)，包膜蛋白E參與病毒的組裝、釋放和發(fā)病機(jī)制，核衣殼蛋白N以不同形式結(jié)合病毒基因組RNA，其中，S蛋白和N蛋白為其主要抗原蛋白。SARS-CoV-2是目前已知的可導(dǎo)致人類疾病的第七種人類冠狀病毒(HCoV)，其他六種類型的HCoV包括α-CoV屬的HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV，其中，SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV被認(rèn)為是高致病性的。實(shí)際上，盡管COVID-19的病死率低于SARS和MERS，但COVID-19的感染人數(shù)和死亡人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SARS和MERS。

目前主要有四種檢測SARS-CoV-2感染的方法：(1)通過將患者的生物樣本接種到細(xì)胞培養(yǎng)物中來分離病毒，如Vero細(xì)胞培養(yǎng)物，該方法需要生物安全3級實(shí)驗(yàn)室設(shè)施；(2)分子生物學(xué)技術(shù)，如逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增、聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)和高通量測序，這是發(fā)現(xiàn)病原體的有力工具；(3)血清學(xué)檢測，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行抗原、抗體檢測，以及免疫過濾、免疫層析試驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法；(4)用針對SARS-CoV-2抗原的特異性抗體進(jìn)行的抗原檢測。