[發(fā)明專利]基于多重等溫循環(huán)擴(kuò)增信號放大的核酸檢測試劑及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210904550.0
• 申請日: 2022-07-29
• 公開（公告）號: CN115927549A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉靜;王茹可;張文旰;王博
• 申請（專利權(quán)）人: 山東科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/682;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京卓勝佰達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 16026
• 代理人: 劉冬梅

本發(fā)明屬于熒光生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多重等溫循環(huán)擴(kuò)增信號放大的核酸檢測試劑及其應(yīng)用。該檢測試劑包括：與待檢測核酸雜交互補(bǔ)的引物a、引物b、DNA聚合酶和DNA內(nèi)切酶。該檢測試劑應(yīng)用在核酸檢測中，能夠可靠地檢測目標(biāo)核酸，將克服傳統(tǒng)EXPAR技術(shù)的關(guān)鍵局限性，靈敏度高，使其在分子診斷領(lǐng)域具有更廣泛的實(shí)際應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于熒光生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多重等溫循環(huán)擴(kuò)增信號放大的核酸檢測試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

核酸是生物的基本遺傳物質(zhì)，是基因表達(dá)的基礎(chǔ)，它控制著蛋白質(zhì)的合成和有機(jī)體細(xì)胞的機(jī)能，在生物的生長、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異等生命活動中占有極其重要的地位。核酸檢測是現(xiàn)代生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)中的重要研究領(lǐng)域，對疾病診斷、基因治療和新型藥物篩選等諸多方面產(chǎn)生非常重要的意義。目前幾種類型的DNA等溫擴(kuò)增核酸檢測方法得到了廣泛的發(fā)展，其中，核酸序列擴(kuò)增(NASBA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、交叉引物擴(kuò)增(COPIESA)等技術(shù)均采用專門設(shè)計(jì)或附加的引物組合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的等溫擴(kuò)增，目標(biāo)核酸作為特殊引物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)。其中，EXPAR技術(shù)因其高的擴(kuò)增效率和短的反應(yīng)時間，過程相當(dāng)簡單頗受青睞。其通過DNA聚合酶和切割內(nèi)切酶的活性靶核酸直接誘導(dǎo)雙鏈指數(shù)放大DNA(dsDNA，但是傳統(tǒng)EXPAR技術(shù)存在需要特殊的儀器設(shè)備進(jìn)行溫度的升降控制，反應(yīng)過程以及操作較為復(fù)雜并且容易產(chǎn)生假陽性信號等缺陷。

所以，一種檢測簡單方便，且靈敏度高的核酸檢測方法是必要的。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上問題，本發(fā)明目的之一在于提供一種基于多重等溫循環(huán)擴(kuò)增信號放大的核酸檢測試劑，該核酸檢測試劑通過將待檢測核酸含量轉(zhuǎn)化成熒光信號，并逐漸放大熒光信號，從而進(jìn)行核酸檢測，檢測靈敏度高；而且檢測是在恒溫條件下進(jìn)行，不需要特殊的儀器設(shè)備，操作簡單，對檢測的目標(biāo)物具有較高的選擇性，可避免假陽性。

為了達(dá)到上述目的，可以采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面提供一種基于多重等溫循環(huán)擴(kuò)增信號放大的核酸檢測試劑，包括：與待檢測核酸雜交互補(bǔ)的引物a、引物b、DNA聚合酶和DNA內(nèi)切酶。需要說明的是，該方法適用于任何核酸的檢測，需要配套設(shè)計(jì)能特異性捕獲靶核酸的引物a，引物b的設(shè)計(jì)原則是一方面能捕獲到釋放的短序列進(jìn)而繼續(xù)進(jìn)行下面的擴(kuò)增反應(yīng)，另一方面是引物b通過延伸裂解和鏈置換能夠生成Mg²⁺-DNA輔酶結(jié)構(gòu)，為后續(xù)檢測熒光信號提供條件。

具體地，在目標(biāo)核酸存在下，通過相應(yīng)的DNA聚合酶和DNA內(nèi)切酶輔助，最后產(chǎn)生Mg²⁺-DNA酶。從而將目標(biāo)核酸檢測巧妙地轉(zhuǎn)換為熒光信號；結(jié)合DNA聚合酶和DNA內(nèi)切酶輔助的等溫循環(huán)擴(kuò)增策略和金屬離子DNA酶的信號放大技術(shù)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的高靈敏、特異性檢測。

進(jìn)一步地，上述核酸檢測試劑還可以包括發(fā)夾DNA和Mg²⁺，在一些具體實(shí)施例中，發(fā)夾DNA還可以包含rA堿基且修飾有FAM和BHQ-1基團(tuán)。

進(jìn)一步地，上述核酸檢測試劑中，引物a包含如SEQIDNO.1所示序列，引物b包含如SEQIDNO.2所示序列。具體地，該引物a和引物b適用于HIV-1免疫缺陷病毒基因的檢測。

需要說明的是，上述核酸檢測試劑中，還包括其他本領(lǐng)域所已知的常規(guī)輔助檢測試劑，比如緩沖液等。

本發(fā)明另一方面提供一種檢測試劑盒，其包含上述的基于多重等溫循環(huán)擴(kuò)增信號放大的核酸檢測試劑。具體地，上述檢測試劑盒的組成為本領(lǐng)域所已知的常規(guī)形式，比如檢測試劑盒會設(shè)置試劑盒說明書，比如會有盛裝各種檢測試劑的試劑瓶，比如會設(shè)置成若干小格子用來放置檢測試劑瓶，比如會有滴管用來移取檢測試劑等。