[發明專利]一種用于復制型病毒檢測的重組表達載體及其應用

在審

• 申請號: 202210891936.2
• 申請日: 2022-07-27
• 公開（公告）號: CN115717155A
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 狄升蒙;茅健;陳鑫;付姣;李照潤;范艷秋;余學軍;梁輝
• 申請（專利權）人: 華道（上海）生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N15/38;C12N7/01;C12N5/10;C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 趙穎

本發明公開了一種用于復制型病毒檢測的重組表達載體及其應用。所述重組表達載體包括含有熒光蛋白的編碼基因和皰疹性口腔炎病毒G蛋白的部分編碼基因的病毒載體。本發明設計特定結構的用于復制型病毒檢測的重組表達載體，利于快速檢測，可進一步用于制備復制型病毒，作為RCL檢測的陽性對照品，利于提高檢測效率、靈敏度、準確性和便捷性，且可適用于多種檢測方法，檢測結果更可靠，安全性更高。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于復制型病毒檢測的重組表達載體及其應用。

背景技術

近年來腫瘤免疫療法和再生醫學產品的臨床研究不斷深入，已有多個CAR-T/TCR-T細胞產品和干細胞/體細胞產品申報藥品臨床試驗，涉及細胞類型多樣，組織來源包括血液、上皮組織、骨髓、脂肪組織、肌肉組織、眼球、臍帶、胎盤和牙髓等。

CAR-T細胞的生產流程主要包括患者的外周血分離、T細胞的活化和富集、將CAR轉入T細胞、CAR-T細胞的體外擴增，以及最終形成制劑。由于轉導效率高、目的基因表達穩定、持續時間長，慢病毒和γ-逆轉錄病毒成為目前將CAR編碼基因轉入T細胞過程中應用最普遍的表達載體，復制型病毒(replication-competent lentivirus，RCL)的產生是慢病毒和γ-逆轉錄病毒載體生產和應用過程中最嚴重的風險因素，迄今，已應用于人體的慢病毒載體及相關細胞產品中尚未有檢出RCL的報道，理論上目前采用的病毒包裝系統降低了RCL出現的可能性，但未能完全排除，因此RCL仍作為重要的安全性風險關注點。

根據RCL產生的機制，人們已經發現了多種可能指示RCL的標志物。例如，包裝質粒和轉移質粒gag起始區域序列的同源性高，因而兩質粒間可能重組產生RCL；另外，擴增得到的以VSV-G作為包膜蛋白的RCL，可能將VSV-G序列遷移至指示細胞的基因組中(參見：Sastry,L.,et al.,Certification assays for HIV-1-based vectors:frequentpassage of gag sequences without evidence of replication-competentviruses.Mol Ther,2003.8(5):p.830-9.)，復制型病毒具有逆轉錄酶活性，PERT(productenhanced reverse transcriptase)的檢出也可指示RCL，但需要考慮到指示細胞自身表達逆轉錄酶的情況(參加：Sastry,L.,et al.,Product-enhanced reverse transcriptaseassay for replication-competent retrovirus and lentivirus detection.Hum GeneTher,2005.16(10):p.1227-36.)，綜上，目前一般認為gag基因編碼的p24蛋白及指示細胞中psi-gag和VSV-G序列的檢出可反映RCL的存在。

對于臨床級別的慢病毒載體，常用的檢測方法有細胞培養法和直接qPCR法。FDA指導原則要求，假設患者的臨床用劑量中含有1個RCL，對應的病毒上清的檢測樣本量應至少確保95％的檢出可能性。直接qPCR法通過RT-PCR擴增待測樣品中RCL的標志性序列(psi-gag，VSV-G)檢測，不涉及RCL在細胞中的擴增過程，耗時較短，檢測方法相對簡便，但該方法具有明顯的缺點，在體外包裝的病毒載體中往往存在殘余質粒DNA的污染導致假陽性結果。此外，重組產生RCL的機制較為復雜，由于病毒包裝系統多樣，產生的RCL可能不具有PCR引物匹配的序列，因而假陰性結果也難以避免。

細胞培養法檢測RCL時，將待測物與對HIV-1易感并且可大量擴增病毒的細胞系(通常用C8166)孵育，細胞傳代5次以上，培養至少3周(擴增期)。3周后收集培養上清，接種于野生型C8166細胞中培養7天后檢測RCL標志物(指示期)。細胞培養法更為靈敏，假陰性結果出現的概率低，但該方法需要使用陽性對照毒株。由于RCL的結構未知，檢測時選擇何種毒株作為陽性對照具有挑戰性。國外有研究指出，使用缺乏輔助基因的HIV弱毒株可以作為RCL檢測的陽性對照(如R8.71病毒)。