[發(fā)明專利]一種中性植酸酶突變體及其應用

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• 申請日: 2022-07-26
• 公開（公告）號: CN115094050A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設計）人: 鮑鍇;吳秀秀;李馨培
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/80;C12N15/81;C12N1/19;C12N1/15;A23K20/189;A23K50/80;C12R1/84;C12R1/885
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本發(fā)明涉及基因工程與蛋白質(zhì)改造技術領域，具體涉及一種中性植酸酶突變體及其應用。本發(fā)明以野生型植酸酶AN為基礎，提供了包含F(xiàn)136T、S181D、F196D、N341Q中至少一個突變位點的突變體。與野生型相比，本發(fā)明提供的植酸酶單點突變體的比活力普遍提高了17.3%?37.1%；而且本發(fā)明提供的包含F(xiàn)136T/N341Q、S181D/F196D/N341Q突變位點組合的植酸酶突變體，其比活力比對應單點突變體得到進一步提高，最高達992.2 U/mg，取得了意料不到的技術效果。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術領域，具體涉及一種中性植酸酶突變體及其應用。

背景技術

植酸又名肌醇六磷酸或環(huán)己六醇磷酸酯，廣泛存在于植物籽實中，是植物性飼料中磷元素的主要儲存形式，但植酸磷不能被動物直接吸收利用，必須在消化道內(nèi)先水解為無機磷酸鹽。水產(chǎn)動物尤其是魚類消化系統(tǒng)中缺乏內(nèi)源性植酸酶，無法利用飼料中的植酸磷，大部分隨糞便排出，造成嚴重的水環(huán)境污染，同時造成磷的浪費。而水產(chǎn)動物對飼料中磷的需要量又高于畜禽，特別是鯉科魚類屬無胃魚，沒有胃酸分泌，通常采用飼料中添加磷酸氫鈣或磷酸二氫鈣等方法來滿足水產(chǎn)動物機體對磷的營養(yǎng)需求。同時，植酸通常與一些二價或三價陽離子，如Ca 2+、Zn 2+、Fe2+等形成不溶性鹽類，阻礙腸道對礦物元素的吸收。在酸性或近中性環(huán)境中植酸還可以與蛋白質(zhì)形成絡合物，影響蛋白質(zhì)的吸收利用，與一些蛋白消化酶類等結合，降低了其活性。因此植酸也被認定為抗營養(yǎng)物質(zhì)，它不僅造成飼料原料的浪費，無形中增加了養(yǎng)殖成本，還導致水產(chǎn)動物糞便中含有大量的氮磷和礦物質(zhì)離子化合物，嚴重污染水環(huán)境。

隨著飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，飼料中未被消化利用的植酸磷對環(huán)境污染日益嚴重，能降解植酸磷的植酸酶已成為飼用酶制劑研究的熱點。以往植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，酸性植酸酶適用于胃pH呈酸性的單胃動物以及少數(shù)魚類，但不適用于消化道為中性的淡水鯉科魚類和畜禽。

植酸酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一類能將植酸及其鹽類催化水解成肌醇和磷酸的酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶。植酸酶作為環(huán)保促生長型飼料添加劑，可提高水產(chǎn)動物飼料中磷的利用率，減少水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中磷對水環(huán)境的污染和水產(chǎn)飼料中礦物質(zhì)磷的添加量，同時能提高植物蛋白和植物飼料能量礦物質(zhì)利用率，從而節(jié)約飼料資源，降低飼料成本，符合我國兩型社會建設要求，其在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中具有廣闊的應用前景。

當前植酸酶主要應用于豬用和禽用飼料，而水產(chǎn)飼料還未使用植酸酶。水產(chǎn)飼料大量使用磷礦石必然帶來的磷污染，不利于環(huán)境保護。其原因是：（1）當前常用的酸性植酸酶耐溫性不超過85℃，而水產(chǎn)飼料制粒溫度超過90℃；因此制粒過程將使酶失活；（2）水體pH為中性或偏中性；而常用于飼料領域的酸性植酸酶pH作用范圍4.0-5.0，在偏中性環(huán)境則幾乎沒有活性。過去二十多年來，經(jīng)過多次的蛋白質(zhì)工程改造，飼用植酸酶耐溫性從不耐溫提升到到耐受85℃的技術進步；但是還是不能滿足水產(chǎn)飼料的制備工藝要求。 因此，開發(fā)耐高溫（大于90℃）、作用pH中性且高產(chǎn)的植酸酶是開發(fā)水產(chǎn)植酸酶市場的關鍵。我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，每年生產(chǎn)水產(chǎn)飼料2000萬噸以上，而且每年以10%速度增長。如果以每噸飼料添加2公斤植酸酶計算，其市場潛力為1萬噸；以50元/kg價格計算，則潛在市場產(chǎn)值為5億人民幣，市場潛力巨大。

但是，目前水產(chǎn)用中性植酸酶面臨產(chǎn)量低、成本高、耐溫性及耐中性環(huán)境差等制約因素。因此，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程方法獲得高產(chǎn)量、低成本適用于商業(yè)化的新型水產(chǎn)植酸酶酶成了亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種中性植酸酶突變體及其應用。所述突變體的比活力比野生型得到顯著提高，有利于降低該酶的生產(chǎn)成本，促進其在水產(chǎn)飼料領域的廣泛應用。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

本發(fā)明涉及一種植酸酶突變體，其包含與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且與SEQ ID NO:1相比在選自下組中的至少一個位置上包含氨基酸的取代：136，181，196，341。