[發明專利]牛支原體SBP-2單克隆抗體制備及其應用

在審

• 申請號: 202210873490.0
• 申請日: 2022-07-21
• 公開（公告）號: CN115372622A
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 郭亞男;何生虎;閆背背;李清利;雷元元;王建東;梁小軍
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院動物科學研究所（寧夏草畜工程技術研究中心）
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/52;C07K16/12
• 代理公司: 北京弘權知識產權代理有限公司 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

1.一種牛支原體SBP-2膠體金檢測試紙，其特征在于，包括樣品墊、金標墊、NC膜、吸水墊和PVC膠板，其中，樣品墊、金標墊、NC膜、吸水墊依次搭接，固定在PVC膠板上，所述金標墊表面均勻設置金標抗體，所述金標抗體中包括SBP-2蛋白單克隆抗體，所述NC膜靠近樣品墊的一端設置一條T線，遠離樣品墊的另一端設置一條C線。

2.根據權利要求1所述的膠體金檢測試紙，其特征在于，所述金標抗體的結合pH為8.0。

3.根據權利要求1所述的膠體金檢測試紙，其特征在于，所述金標抗體中SBP-2蛋白單克隆抗體的標記濃度為40μg/mL。

4.根據權利要求1所述的膠體金檢測試紙，其特征在于，所述T線是T液在NC膜上畫的一條線，所述T液包括PB緩沖液和純化的SBP-2蛋白單克隆抗體。

5.根據權利要求1所述的膠體金檢測試紙，其特征在于，所述C線是C液在NC膜上畫的一條線，所述C液包括PB緩沖液和純化蛋白A。

6.根據權利要求1所述的膠體金檢測試紙，其特征在于，所述NC膜的孔徑為0.1μm。

7.一種單克隆抗體的制備方法，制備權利要求1所述的SBP-2蛋白單克隆抗體，其特征在于，包括：

以原核表達的純化后SBP-2蛋白為免疫原，對4～5周齡的雌性小鼠進行多次免疫，得到陽性小鼠，所述SBP-2蛋白來源于一種大腸桿菌，所述大腸桿菌保藏號為CGMCC NO:23133；

取陽性小鼠的脾細胞，將所述脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞；

所述的雜交瘤細胞進行二次篩選和第二次克隆后，得到穩定分泌異性抗體的雜交瘤細胞，所述二次篩選分別是ELISA檢測方法初篩和Western blot復檢；

腹腔注射所述穩定分泌異性抗體的雜交瘤細胞，采集腹水，得到所述SBP-2蛋白單克隆抗體，所述SBP-2蛋白單克隆抗體是IgG1亞類。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述對雌性小鼠進行多次免疫，得到陽性小鼠的步驟中，還包括：

取200μg抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，在小鼠的頸部、腹部、腳掌等皮下部位進行多點注射進行首次免疫，得到首次免疫小鼠；

在首次免疫后2周，取100μg抗原與等體積的弗氏不完全佐劑完全乳化后，在所述首次免疫小鼠的頸部、腹部、腳掌等皮下部位進行多點注射進行二次免疫，得到二次免疫小鼠；

在二次免疫后2周，取100μg抗原與等體積的弗氏不完全佐劑完全乳化后，在所述二次免疫小鼠的頸部、腹部、腳掌等皮下部位進行多點注射進行三次免疫，得到三次免疫小鼠；

在三次免疫后1周，剪所述三次免疫小鼠的尾尖采血50μL左右，37℃恒溫培養箱中靜置1h后，4℃過夜，3000r/min離心30min分離血清，取適量血清用ELISA方法檢測小鼠抗體效價，得到抗體效價高的小鼠；

取不加任何佐劑的400μg抗原腹腔注射所述抗體效價高的小鼠，得到陽性小鼠。