[發明專利]一種可篩除假陽性愈傷組織的植物基因編輯重組載體及應用

在審

• 申請號: 202210871881.9
• 申請日: 2022-07-22
• 公開（公告）號: CN115851756A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 張建鐸;邢佳鑫;王晉;楊光宇;孔維松;鄧樂樂;楊文武;許力;蔣佳芮;高茜;向海英;曾婉俐;李雪梅
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京維澳專利代理有限公司 11252
• 代理人: 隋勤

本發明公開了一種可篩除假陽性愈傷組織的植物基因編輯重組載體及應用。該重組載體可篩除假陽性愈傷組織及轉化株，重組載體中包含NtAN2基因元件，是將一個NtU4M啟動子驅動，35S終止的含有NtAN2基因元件的表達框加入到T?DNA中，與基因編輯其他元件形成一個連鎖的重組載體；整個表達框序列為SEQ ID No.1。采用本發明的方案進行植物基因編輯技術創制突變體時，在抗性愈傷組織階段通過肉眼可辨的紅色即可判定愈傷組織是否為轉基因假陽性。假陽性愈傷組織的篩除減少了假陽性植株的出現，降低了后期對假陽性植株的栽培、檢測等步驟的投入，使有效發生基因編輯植株出現的概率也進一步提高。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，特別涉及一種可篩除假陽性愈傷組織的植物基因編輯重組載體及應用。

背景技術

CRISPR/Cas9技術自2012年開發至今，已在基因編輯領域得到廣泛應用。其構成包含人工改造的引導RNA(sgRNA)和Cas9核酸酶兩個部分。基因編輯原理是在Cas9核酸酶表達框中加入核定位信號(NLS)，Cas9在細胞質中翻譯后由核定位信號引導進入細胞核與sgRNA結合，sgRNA中加入20nt序列特異的引導序列，二者形成復合體，識別sgRNA中20nt特異序列互補的DNA位點，切割形成DNA雙鏈斷裂。通常情況下DNA的修復以非同源末端連接(NHEJ)方式為主，會形成短片段的Indel(堿基插入或刪除)，造成靶基因的移碼突變。

在植物基因編輯的實施過程中一般需要組織培養形成抗性愈傷組織，抗性愈傷組織分化形成抗性植株。組織培養過程中會存在假陽性抗性愈傷組織，假陽性抗性愈傷組織會進一步分化成假陽性植株，在大規模突變體創制中假陽性愈傷組織的出現，增加了編輯植株的篩選范圍和難度，使得檢測成本大幅提升。

目前現有傳統的熒光蛋白、GUS、熒光素酶等基因也可以用于假陽性愈傷組織的排除篩選。這些基因的檢測要么需要借助昂貴儀器，要么需要特異底物做催化反應，在大規模突變體創制應用中存在很大局限。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種可篩除假陽性愈傷組織的植物基因編輯重組載體及應用，其克服了現有技術的上述缺陷,解決組培階段存在假陽性愈傷組織的問題，促進利用基因編輯技術的大規模突變體創制。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種植物基因編輯中的重組載體，所述重組載體可篩除假陽性愈傷組織，所述重組載體中包含NtAN2基因元件，是將一個NtU4M驅動，35S終止的含有NtAN2基因元件的表達框加入到T-DNA中，與基因編輯其他元件形成一個連鎖的重組載體；整個表達框序列為SEQID No.1。

優選地，基因元件能行使基因編輯功能，NtAN2基因是來源于煙草的MYB轉錄因子，用于促進植物花青素的合成。

優選地，UNS表達框能表達產生調控花青素合成的蛋白，導致植物組織中大量積累花青素，產生肉眼可見的紅色，使整個愈傷組織呈現紅色。

一種可篩除假陽性愈傷組織的重組載體在篩除假陽性愈傷組織中的應用。

一種可篩除假陽性愈傷組織的重組載體在篩除假陽性愈傷組織中的應用，包括以下步驟：

(1)NtAN2基因元件及表達框的制備：NtAN2基因由NtU4M啟動子驅動，35S終止子終止，整個表達框序列為SEQ ID No.1，并利用上下游各含有骨架載體兩端15bp同源序列的引物PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化，獲得該表達框線性化DNA片段；

(2)重組載體的構建：利用限制性內切酶KasI和HindIII雙酶切骨架載體pORE-Cas9，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化的線性化骨架DNA，將NtAN2表達框線性化DNA與純化的線性化骨架DNA進行重組反應；將重組產物轉化進入大腸桿菌，經篩選、測序獲得基因編輯重組載體pORE-Cas9/NtAN2；