[發(fā)明專利]一種酪氨酸酶及其工程菌、制備方法和應用

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• 申請日: 2022-07-22
• 公開（公告）號: CN115851631A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設計）人: 劉逸寒;王琛;賈龍剛;路福平
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/75;C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19;C12R1/07
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及一種酶活力提高的酪氨酸酶突變體及其制備。本發(fā)明通過分子生物學技術手段獲得來自阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)的酪氨酸酶基因，利用迭代飽和突變技術對突變體G43R酪氨酸酶基因進行突變，得到酪氨酸酶突變體G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W，及其編碼基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，重新構建重組質(zhì)粒，并實現(xiàn)了其在解淀粉芽孢桿菌中的高效表達，通過發(fā)酵、提取等技術獲得高活力的酪氨酸酶。

技術領域：

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及迭代飽和突變技術獲得酶活力提高的酪氨酸酶突變體及其制備。

背景技術：

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR,EC 1.14.18.1)又稱多酚氧化酶和兒茶酚氧化酶等，是一種參與黑色素合成的“3”型雙核含銅金屬酶。在分子氧存在的條件下，酪氨酸酶可以單酚為底物進行兩次連續(xù)的反應，首先，將單酚作為底物進行催化，生成鄰苯二酚，進一步以鄰苯二酚為底物，氧化生成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)會自發(fā)的聚合形成黑色素。酪氨酸酶廣泛存在于人體、動植物以及微生物中，在不同來源的酪氨酸酶中，其活性位點是高度保守的，均有六個組氨酸殘基協(xié)調(diào)兩個銅離子激活酪氨酸酶活性。

在哺乳動物體內(nèi)，酪氨酸酶催化生成的黑色素，可以起到動物皮膚、毛發(fā)等組織細胞中的染色作用，幫助眼睛與皮膚抵御紫外線輻射，哺乳動物酪氨酸酶功能的衰退與缺失還會引起白化病和白癜風，常見的帕金森病也與其有關；在植物中酪氨酸酶更多被稱為多酚氧化酶，參與單寧和黃酮類的酚類聚合物的合成，引起水果和蔬菜等植物的褐變；在昆蟲體內(nèi)酪氨酸酶常以酶原形式存在，在昆蟲的不同部位完成不同的生理功能，是昆蟲角質(zhì)硬化唯一用到的酶，在節(jié)肢動物中還參與到傷口愈合等生理過程。

目前，酪氨酸酶已在多個領域中具有廣泛應用。在生物醫(yī)藥的應用方面，目前左旋多巴主要的合成方法是化學合成，存在反應過程復雜和需要金屬催化劑等問題，而左旋多巴是酪氨酸酶以酪氨酸為底物的第一個產(chǎn)物，因此，可以利用酪氨酸酶催化酪氨酸合成左旋多巴；在蛋白質(zhì)交聯(lián)方面，在食品加工中，蛋白質(zhì)會因為其所處條件的變化發(fā)生蛋白質(zhì)的交聯(lián)，使其結(jié)構發(fā)生變化，對食品的特性影響很大，直接導致產(chǎn)品的營養(yǎng)與性質(zhì)的改變，相比于傳統(tǒng)交聯(lián)劑，酪氨酸酶的底物特異性更廣泛，目前已有很多使用酪氨酸酶作為肉類、奶制品和植物蛋白食品的交聯(lián)劑的應用；在環(huán)境保護方面，苯酚、甲酚等酚類化合物具有毒性且不易降解，大多數(shù)酚類化合物被認為是環(huán)境污染物，對泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成負面影響。通過離子交換、光催化和酶生物催化降解法去除酚類化合物。酪氨酸酶由于其可以酚類物質(zhì)為底物，催化生成醌類物質(zhì)，可以對苯酚等有毒有機物進行催化脫毒；在生物檢測方面，酪氨酸酶由于可以特異性識別酚類物質(zhì)而被開發(fā)出一些生物檢測器，用于檢測例如紅酒等樣品中的多酚含量。

酪氨酸酶幾乎存在于自然界的各個領域，參與各種生物學功能。目前已經(jīng)有多種包括真菌、細菌、動物等不同來源的酪氨酸酶被分離純化，并成功獲得了多個來源酪氨酸酶的晶體結(jié)構。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的酪氨酸酶氨基酸殘基數(shù)目相差較大，但大部分成熟的酪氨酸酶蛋白的分子量為35-50kDa左右。

酶分子改造是改善蛋白質(zhì)功能和活性的重要手段，主要包括定向進化、理性設計和半理性設計，在對蛋白質(zhì)結(jié)構及其催化位點不了解的情況下多選擇定向進化手段對酶分子進行改造，隨著更多的蛋白質(zhì)結(jié)構被解開和計算機對蛋白質(zhì)結(jié)構預測的發(fā)展，越來越多的采取理性設計和半理性設計對酶分子進行改造，通過對蛋白質(zhì)結(jié)構及其催化機制的分析，理性的分析和選擇可能影響蛋白質(zhì)活性的和功能的氨基酸位點，通過定點突變獲得較少突變體，建立篩選體系，達到快速高效篩選得到理想突變體的目的，相比于定向進化，具有更高的效率和更少的工作量。