[發(fā)明專利]一種同時獲取全基因組轉(zhuǎn)錄和蛋白-DNA結(jié)合信息的測序方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210868907.4
• 申請日: 2022-07-21
• 公開（公告）號: CN115851876A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方東;陳潔
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)紹興研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C12N15/11;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.一種同時獲取全基因組轉(zhuǎn)錄和蛋白-DNA結(jié)合信息的測序方法，所述方法包括：

(1)分離待測樣品組織，進(jìn)行消化，得到細(xì)胞樣品用于后續(xù)實驗；

(2)將細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解得到細(xì)胞裂解液，向細(xì)胞裂解液中加入預(yù)先用結(jié)合液清洗的ConA包被的磁珠，混勻并在室溫孵育10～15min；

(3)結(jié)合在ConA磁珠上的細(xì)胞核利用pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物進(jìn)行抗體識別，構(gòu)建蛋白-DNA組文庫；

(4)未與ConA磁珠結(jié)合的上清轉(zhuǎn)移至RNase-free的管中，低溫離心去除基因組DNA后，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述結(jié)合液組成如下：氯化鉀0.5mM，亞精胺0.5mM，氯化錳2mM，PMSF 1mM，Triton X-100 0.5％，甘油20％，溶劑為20mMHEPES緩沖液。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物按如下方法制備：將Tn5轉(zhuǎn)座子接頭引物Tn5-A和Tn5-B分別與等量的5’端磷酸化引物Tn5rev寡核苷酸退火雜交，在95℃反應(yīng)5min后降至25℃；將退火得到的Tn5-A、Tn5-B與pA-Tn5蛋白于室溫混合0.5～h得到pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物；

所述引物Tn5-A序列為：

5’-TCGTCGGCAGCGTCXXXXXXXXGCGATCGAGGACGGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，其中XXXXXXXX代表細(xì)胞標(biāo)簽；

所述引物Tn5-B序列為：

5’-GTCTCGTGGGCTCGGXXXXXXXXCACCGTCTCCGCCTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，其中XXXXXXXX代表細(xì)胞標(biāo)簽；

所述5’端磷酸化引物Tn5rev序列為：

5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述蛋白-DNA組文庫按如下方法構(gòu)建：樣品DNA與上游引物、下游引物、2×高保真PCR酶混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入核酸外切酶I，37℃孵育30min，80℃孵育20min后，將產(chǎn)物、通用引物、特異P7-T引物、水和2×高保真PCR酶預(yù)混液混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；使用磁珠純化產(chǎn)物DNA，室溫孵育后醇洗、水洗脫，得到蛋白-DNA組文庫；

所述上游引物序列為：

5’-CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC TTCGTCGGCAGCGTCTCCACGC-3’；

所述下游引物序列為：

5’-GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCTCGTGGGCTCGGCTGTCCCTGT-3’；

所述通用引物序列為：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；

所述特異P7-T引物序列為：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其中XXXXXXXX代表index。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄組文庫按如下方法構(gòu)建：樣品cDNA與上游引物、下游引物、2×高保真PCR酶混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入核酸外切酶I，37℃孵育30min，80℃孵育20min后，將產(chǎn)物、通用引物、特異P7-T引物、水和×高保真PCR酶預(yù)混液混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；使用磁珠純化產(chǎn)物DNA，室溫孵育后醇洗、水洗脫，得到轉(zhuǎn)錄組文庫；

所述上游引序列為：

5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGTCGGCAGCGTCTCCACGC-3’；

所述下游引序列為：

5’-GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCTCGTGGGCTCGGCTGTCCCTGT-3’；

所述通用引物序列為：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；

所述特異P7-T引物序列為：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其中XXXXXXXX代表index。