[發明專利]黃瓜接種假單胞菌后內參基因篩選及應用

在審

• 申請號: 202210866598.7
• 申請日: 2022-07-22
• 公開（公告）號: CN115873971A
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 田永強;王雪蕓;冀婷婷;馬斯;高麗紅
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/29;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發明提供黃瓜接種假單胞菌后內參基因篩選及應用。本申請發現黃瓜CACS基因在假單胞菌處理下不同時期表達穩定，可以用作內參基因，為根際促生菌假單胞菌屬有益于黃瓜生長發育及逆境脅迫的生物學研究奠定方法學基礎。

技術領域

本發明屬于植物分子生物學技術領域，具體涉及黃瓜接種假單胞菌后內參基因篩選及應用。

背景技術

近年來我國設施蔬菜的面積源源不斷地增加，至2016年我國設施蔬菜的面積高達391.5萬公頃黃瓜是目前設施生產中最為重要的蔬菜作物之一，其在我國大部分地區均有種植。由于設施栽培中存在連作障礙以及復種指數不斷提高等問題，導致大量病蟲害不斷發生，嚴重影響黃瓜的生長發育以及其產品品質，降低產量。優質高抗的品種是黃瓜綠色高效生產的重要保障，而優良品種的培育離不開高效的育種技術，由于黃瓜遺傳背景狹窄，在全基因組序列信息破譯之前，相關分子生物學研究進展緩慢。黃瓜是植物生物學中的一個新模式物種，因為它具有許多理想的特性，包括基因數量少、雌雄基因表達多樣性豐富、(短生命周期較短(從種子到種子僅需三個月的周期)以及根癌農桿菌介導的轉化已經實現。黃瓜的生理生化和育種研究已有幾十年的歷史，利用黃瓜基因組序列進一步研究黃瓜的分子生物學已變得更加現實。

黃瓜的起源是熱帶潮濕的森林地帶，由于其長期處于水肥充足且有機質也比較豐富的土壤和潮濕且多雨的環境中，形成了其根系比較淺、葉片比較大、喜歡濕度和溫度都比較大的環境，且有較強的耐光性等特征。植物通過根系吸收水分和養分，且強大的植物根系不僅能夠改良土壤的結構和成分而且可以從土壤中吸收植物生長所必須的水分和養分，植物的根系對增強土壤的抗破碎力起著重要的作用。植物根系不僅時強大的吸收器官、活躍的代謝器官和合成器官，同時也是一個分泌器官。根系分泌物對植物的生長有促進和抑制作用，早期首先觀察到根際分泌物能夠促進豆科植物的固氮作用，逐漸認識到根系分泌物的性質及作用。根系分泌物主要通過影響根際微生物來改善植物的生態環境，促進植物的生長，同時增加植物的抗逆性。假單胞菌屬是近年來發現的一類有益的根際促生菌，研究發現該菌屬能促進植物的生長發育，增加植物的生物量，促進植物的抗鹽、同時也能增加植物的一些抗病性等。因此，植物促生菌很大可能是以后研究的重點，通過分子生物學手段了解其是怎么促進生物生長和抗逆的。

使用基因表達模式分析是揭示基因表達調控機制與功能的重要方法。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)是檢測基因表達和研究基因功能的重要工具。與半定量PCR和Northern雜交相比，qRT-PCR具有靈敏度高、特異性廣、定量范圍廣等優點，目前RT-qPCR已被廣泛應用于基因的表達分析。但其分析結果的準確性容易受到RNA完整性、cDNA質量、引物特異性等多種因素的影響。因此，為了獲得準確、可靠的基因表達結果，RT-qPCR結果必需配以合適的內參基因來進行校正和標準化，以消除這些因素造成的干擾。研究發現，在不同的實驗條件或組織樣品中，選擇參考基因的標準也不同，因此有必要篩選參考基因。目前在黃瓜生長發育和非生物脅迫表達穩定的內參基因如TUB和ACT常被選擇，由于不同的實驗選擇不同的內參，TUB和ACT不一定適應于假單胞菌屬處理下的內參基因。因此，選擇能夠在根際促生菌假單胞菌屬下穩定表達的內參基因是研究根際促生菌假單胞菌屬促進黃瓜生長發育及抗逆的分子機制的關鍵。

發明內容

為解決上述問題，我們運用生物信息學及查閱文獻預測篩選了13個黃瓜內參，選其在生長發育和逆境脅迫下表達相對較穩定，檢測其在新泰密刺自交系品種中根部組織即全根中的表達情況，檢測其在不同時期的Ct值得變化范圍，觀測其是否穩定；并利用geNorm法、Norm Finder法和Best Keeper法進行分析，并進一步利用RefFinde算法，對13個內參基因在根際促生菌假單胞菌屬處理后在全根中的表達變化進行比較分析，篩選出特定條件下表達相對最穩定的內參基因。