[發明專利]一種體外分離培養循環腫瘤細胞的方法

有效

• 申請號: 202210859836.1
• 申請日: 2022-07-22
• 公開（公告）號: CN114921414B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 吳少波;許冰
• 申請（專利權）人: 北京和沛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 盧雪梅

1.一種體外分離培養循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，包括：

（1）分離：將癌癥患者的外周血或胸水樣本用無菌生理鹽水稀釋，直接采用高密度微孔陣列膜過濾，所述高密度微孔陣列膜上每平方厘米的孔數為92-98萬個孔/ cm²，孔徑為6-8μm；然后用無菌生理鹽水或磷酸緩沖液PBS清洗高密度微孔陣列膜，進行CTC鏡檢及成活細胞檢測；

（2）培養：在無菌操作條件下，將高密度微孔陣列膜轉移至培養皿，加入培養液，進行培養，建立循環腫瘤細胞體外培養的方法；

步驟（2）中，培養液包括基本培養基和添加物，

所述基本培養基包括體積比為1:1的RPMI 1640和DMEM/F12；

所述添加物的組成及含量包括：體積百分比為2%的胎牛血清FBS；質量百分比為0.05%的牛血清白蛋白BSA；非必需氨基酸NAAS，1X使用濃度，從100X NAAS母液配制；抗生素，1X使用濃度，從1000X三類混合抗生素母液配制，所述三類混合抗生素為青霉素，鏈霉素及抗支原體抗生素；1-2 μg/mL轉鐵蛋白；25-50 μg/mL人胰島素；300-500 ng/L hEGF以及5-10ng/L hFGF；

所述癌癥患者所患的癌癥為肝癌、胃癌、結直腸癌、宮頸癌、肺癌、淋巴癌或乳腺癌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，采用高密度微孔陣列膜過濾包括一級過濾或多級過濾；多級過濾時，高密度微孔陣列膜的孔徑逐級減小。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，將癌癥患者的外周血樣本采用無菌生理鹽水稀釋2-5倍，輕輕充分混勻，放置于室溫3~5分鐘，然后進行過濾。

4.根據權利要求1-3任意一項所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，在37℃細胞培養箱中培養，5％CO₂飽和度，每隔3~4天更換培養液；單個CTC經3~5天，長成小細胞團CTM，1~2周長成更大的細胞團，有的CTC細胞團會脫落或分散開來形成單個懸浮細胞或附著分化細胞。

5.根據權利要求1-3任意一項所述的方法，其特征在于，采集癌癥患者的外周血后，加入CPDA-1抗凝劑，混勻，可在4℃下保存3~5周，備用；外周血與CPDA-1抗凝劑的體積比為1：0.15。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，外周血與CPDA-1抗凝劑混合后，還加入抗生素和/或血小板抑制劑鹽酸替羅非班；混合液中，抗生素為1X；血小板抑制劑鹽酸替羅非班在混合液中的質量濃度為2-10 μg/mL。

7.根據權利要求1-3任意一項所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，采用無菌生理鹽水或PBS緩沖液清洗高密度微孔陣列膜3~4次，加入PBS緩沖液，進行CTC鏡檢及成活細胞檢測。